肉鸡肠上皮细胞抗氧化酶系统表达和调控研究

发布时间：2017-07-14 14:03

  本文关键词：肉鸡肠上皮细胞抗氧化酶系统表达和调控研究

  更多相关文章： 肉鸡 抗氧化酶系统 吸收效率 肠上皮细胞 氧化应激 Nrf2 MAPK

【摘要】：肠道抗氧化酶系统在氧化应激中起到重要作用。本研究首先探讨了肉鸡肠道抗氧化酶系统的时空表达规律及与吸收能力的关系;其次建立了鸡肠上皮细胞的原代培养技术,并利用H2O2建立了体外氧化应激模型。初步探讨了Nrf2以及MAPK信号通路参与氧化损伤的调控机制。本研究为家禽肠道发育提供了理论支持,为肠道损伤机制的研究奠定了科学基础。试验一肉鸡鸡肠道抗氧化酶系统的时空表达规律肠道抗氧化酶系统的时空表达规律律。。选取1日龄AA肉鸡120只,随机分成8组,每组15只。分别在1、3、7、11、14、21及35日龄采集十二指肠、空肠、回肠、心脏、肝脏和肾脏进行抗氧化酶表达检测。结果显示,肉鸡肠道抗氧化酶活性显著低于心脏、肝脏和肾脏;肠道中CAT和GPx的活性随日龄增长显著下调,抗氧化酶系统相关基因m RNA表达水平显著下调(P0.05),肠道发育过程中Nrf2的m RNA表达量降低(P0.05);35d肠道CAT活性显著高于肠粘膜,但m RNA表达水平较粘膜低(P0.05);免疫组化结果表明,肠道抗氧化酶主要存在于粘膜层的肠绒毛上皮细胞内。以上结果表明肠道抗氧化酶随日龄增加表达量降低,Nrf2可能对该过程起调控作用。试验二不同同吸收效率肉鸡肠道抗氧化吸收效率肉鸡肠道抗氧化化酶酶酶系统分析系统分析析。。利用D-木糖吸收测试筛选不同吸收效率的肉鸡。比较不同吸收效率的肉鸡血清抗氧化系统及肠道抗氧化酶、形态结构和养分转运载体表达的差异。24日龄和28日龄对肉鸡进行D-木糖吸收测试,筛选出的两组肉鸡血清内D-木糖含量均显著差异(P0.05);高吸收组肉鸡血清内T-SOD活性(P0.05)以及MDA含量(P=0.10)低于低吸收组肉鸡;高吸收组肉鸡回肠CAT活性明显高于低吸收组(P0.05);高吸收组回肠绒毛高度和回肠绒毛高度/隐窝深度显著高于低吸收组(P0.05);两组肉鸡肠道SGLT1、CAT1、CAT2和b0,+AT的表达存在差异(P0.05)。以上结果表明D-木糖吸收试验可以成功筛选出不同吸收效率的肉鸡,其原因可能是肠道形态和养分载体表达不同,但吸收效率对肠道抗氧化酶系统无明显影响。试验三鸡鸡肠上皮细胞肠上皮细胞胞的的的分离分离离、、、培养和鉴定培养和鉴定定。。选取18胚龄的SPF鸡胚,分离十二指肠,使用机械挤压和?型胶原酶消化联合获取肠粘膜上皮细胞。48h贴壁生长后,显微镜下观察可见铺路石状细胞;通过H.E和吉姆萨染色确定上皮细胞形态;电子显微镜显示有微绒毛、紧密连接结构和桥粒等超微结构;检测结果表明分离培养的上皮细胞能够表达特异性蛋白:碱性磷酸酶、CK18及Claudin-1。以上结果表明肠上皮细胞原代培养方法建立成功。试验四氧化应激对对肠上皮细胞肠上皮细胞胞的的的影响影响响。。分别用5mmol/m L和10mmol/m L的H2O2刺激原代鸡肠上皮细胞1h。结果显示随H2O2浓度升高,细胞抗氧化酶系统表达下降,氧化损伤加重;氧化应激导致肠上皮细胞ERK1/2、JNK和p38蛋白磷酸化水平上调(P0.05);肠上皮细胞Nrf2及其下游基因的m RNA表达水平显著下调(P0.05)。以上结果表明H2O2处理能够造成肠上皮细胞急性氧化损伤,破坏抗氧化-氧化平衡,同时MAPK信号通路及Nrf2信号通路可能参与调控氧化应激。
【关键词】：肉鸡 抗氧化酶系统 吸收效率 肠上皮细胞 氧化应激 Nrf2 MAPK
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S831
【目录】：

• 英文缩略词表4-10
• 中文摘要10-12
• Abstract12-15
• 1 前言15-25
• 1.1 抗氧化系统的基础概念15-21
• 1.1.1 氧自由基相关理论15-16
• 1.1.2 机体抗氧化系统16-20
• 1.1.2.1 抗氧化酶系统16-19
• 1.1.2.2 抗氧化物系统19-20
• 1.1.3 氧化应激20-21
• 1.2 氧化应激相关信号通路21-24
• 1.2.1 Nrf221-22
• 1.2.2 Keap122
• 1.2.3 抗氧化反应元件22-23
• 1.2.4 Nrf2信号通路的激活23-24
• 1.3 本研究的目的和意义24-25
• 2 材料与方法25-46
• 2.1 试验动物管理25
• 2.2 试验鸡胚25
• 2.3 试验细胞系25
• 2.4 试验试剂与主要仪器25-30
• 2.5 试验设计30-33
• 2.5.1 肉鸡肠道抗氧化酶系统的时空表达规律30-31
• 2.5.1.1 试验处理30
• 2.5.1.2 样品采集30-31
• 2.5.1.3 测定指标31
• 2.5.2 不同吸收效率肉鸡肠道抗氧化系统分析31-32
• 2.5.2.1 试验处理31
• 2.5.2.2 样品采集31
• 2.5.2.3 测定指标31-32
• 2.5.3 鸡肠上皮细胞的分离、培养与鉴定32
• 2.5.3.1 试验处理32
• 2.5.3.2 样品采集32
• 2.5.3.3 测定指标32
• 2.5.4 氧化应激对肠上皮细胞的影响32-33
• 2.6 试验方法33-45
• 2.6.1 细胞培养和检测33-36
• 2.6.1.1 原代鸡肠上皮细胞培养33
• 2.6.1.2 原代鸡胚成纤维细胞培养33-34
• 2.6.1.3 细胞系的培养34
• 2.6.1.4 上皮细胞H.E染色34
• 2.6.1.5 上皮细胞吉姆萨染色34-35
• 2.6.1.6 细胞荧光免疫35
• 2.6.1.7 肠上皮细胞活力测定35
• 2.6.1.8 肠上皮细胞扫描电镜35-36
• 2.6.1.9 肠上皮细胞透射电镜36
• 2.6.2 肠道组织形态学观察检测36-37
• 2.6.2.1 肠道组织H.E染色观察36
• 2.6.2.2 肠道组织抗氧化酶免疫组化检测36-37
• 2.6.3 MDA检测方法37-38
• 2.6.3.1 血清MDA检测37-38
• 2.6.3.2 组织和细胞MDA检测38
• 2.6.4 mRNA表达水平检测38-44
• 2.6.4.1 总RNA提取38-39
• 2.6.4.1.1 组织中总RNA提取38-39
• 2.6.4.1.2 肠上皮细胞中总RNA提取39
• 2.6.4.2 总RNA浓度测定39
• 2.6.4.3 总RNA琼脂糖凝胶电泳39-40
• 2.6.4.4 总RNA反转录40
• 2.6.4.5 荧光定量 PCR40-44
• 2.6.5 蛋白提取和Western Blotting44-45
• 2.6.5.1 细胞蛋白提取44
• 2.6.5.2 蛋白浓度测定44
• 2.6.5.3 蛋白变性44
• 2.6.5.4 Western Blotting44-45
• 2.6.6 抗氧化酶系统测定方法45
• 2.7 数据处理45-46
• 3 结果与分析46-74
• 3.1 肉鸡肠道抗氧化酶系统的时空表达规律46-57
• 3.1.1 肉鸡相同日龄各组织抗氧化酶活性变化规律46-48
• 3.1.2 肉鸡不同日龄肠道抗氧化酶表达变化规律48-51
• 3.1.3 肉鸡不同日龄肠道抗氧化酶免疫组化变化51-53
• 3.1.4 肉鸡肠道不同部位抗氧化酶表达规律53-57
• 3.2 不同吸收效率肉鸡肠道抗氧化酶系统分析57-61
• 3.2.1 D-木糖吸收测试筛选结果57-58
• 3.2.2 不同吸收效率肉鸡血清和肠道抗氧化酶系统比较58-60
• 3.2.3 不同吸收效率肉鸡肠道形态结构比较60
• 3.2.4 不同吸收效率肉鸡肠道转运载体表达量比较60-61
• 3.3 鸡肠上皮细胞的分离、培养及鉴定61-67
• 3.3.1 鸡肠上皮细胞的分离61-62
• 3.3.2 鸡肠上皮细胞的培养与鉴定62-67
• 3.3.2.1 鸡肠上皮细胞普通形态鉴定62-64
• 3.3.2.2 鸡肠上皮细胞微观结构鉴定64-65
• 3.3.2.3 鸡肠上皮细胞特异蛋白鉴定65-67
• 3.4 氧化应激对肠上皮细胞的影响67-74
• 3.4.1 过氧化氢对肠上皮细胞活性的影响67
• 3.4.2 氧化应激对肠上皮细胞形态的影响67-69
• 3.4.3 氧化应激对肠上皮细胞抗氧化系统表达的影响69-70
• 3.4.4 氧化应激对肠上皮细胞抗氧化系统调控的影响70-74
• 4 讨论74-86
• 4.1 肉鸡肠道抗氧化酶的时空表达规律74-77
• 4.1.1 肉鸡相同日龄各组织抗氧化酶活性变化规律74-75
• 4.1.2 肉鸡肠道抗氧化酶系统表达变化规律75-76
• 4.1.3 肉鸡肠道不同部位抗氧化酶变化规律76-77
• 4.2 不同吸收效率肉鸡肠道抗氧化酶系统分析77-81
• 4.2.1 D-木糖吸收试验77-78
• 4.2.2 不同吸收效率对肉鸡肠道形态结构的影响78
• 4.2.3 不同吸收效率对肉鸡肠道转运载体表达量的影响78-80
• 4.2.4 不同吸收效率对肉鸡血清和肠道抗氧化酶系统的影响80-81
• 4.3 鸡肠上皮细胞的分离、培养及鉴定81-84
• 4.3.1 鸡肠上皮细胞的分离81-83
• 4.3.2 鸡肠上皮细胞的培养与鉴定83-84
• 4.3.2.1 鸡肠上皮细胞形态鉴定83
• 4.3.2.2 鸡肠上皮细胞特异蛋白表达83-84
• 4.4 氧化应激对肠上皮细胞的影响84-86
• 4.4.1 氧化应激对肠上皮细胞活性的影响84-85
• 4.4.2 氧化应激对肠上皮细胞形态的影响85
• 4.4.3 氧化应激对肠上皮细胞抗氧化系统表达的影响85
• 4.4.4 氧化应激对肠上皮细胞抗氧化系统调控的影响85-86
• 5 总体结论86-87
• 6.创新点和展望87-88
• 6.1 创新点87
• 6.2 展望87-88
• 参考文献88-107
• 致谢107

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本文编号：541332