小反刍兽疫病毒N75-1株在山羊子宫内膜上皮细胞中的增殖规律研究

发布时间：2017-07-14 18:09

  本文关键词：小反刍兽疫病毒N75-1株在山羊子宫内膜上皮细胞中的增殖规律研究

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【摘要】：小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种感染山羊、绵羊的急性高度传染性疾病。PPR是世界动物卫生组织(OIE)法定报告动物疾病,我国将此病列为一类动物疾病。近年来,PPR疫情在包括我国在内的世界多个国家已发生或正在发生,对疫情国公共卫生及养羊行业造成了重大威胁。加强对PPRV的检测分析及其增殖规律研究对于PPR防控具有重要意义。本研究根据GenBank上已发表的PPRV-N基因序列,设计合成了一对扩增N基因的特异性引物,通过基因扩增,载体构建及标准阳性质粒的梯度稀释,建立了用于检测PPRV实时荧光定量PCR方法。利用建立的荧光定量PCR方法以及Western blot法对PPRV N75-1疫苗株在山羊子宫内膜上皮细胞(EEC)内的增殖规律进行了检测分析,获得的结果如下:1.成功建立了用于检测PPRV的实时荧光定量PCR方法,结果表明建立的标准曲线相关系数R2=0.973,扩增效率为126.0%。该法特异性强、敏感度高、重复性好,可用于对PPRV的定量检测。2.PPRV能够引起EEC细胞发生细胞病变,接种PPRV 48h后EEC细胞开始出现早期轻微细胞病变效应(CPE),至72h后细胞CPE较为明显,96h细胞开始出现裂解现象。接种MOI=10的PPRV N75-1株,分别在0h、1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h、72h收取细胞,通过建立的qPCR方法检测病毒增殖水平,发现接种后3h时N基因转录水平有一定的升高,6h时有明显的升高,在接种后9h达到了最高的水平,从接种后12h开始下降,然后形成了一个稳定的状态。用Western blot方法检测N蛋白的表达情况,1h即可以检测到N蛋白的表达,且N蛋白在细胞内的表达量6h有明显上升,12h后有明显的下降。通过本研究,成功建立了基于N基因检测PPRV的实时荧光定量PCR法,并对PPRV N75-1在EEC内的增殖规律进行了检测分析,为深入研究PPRV对山羊生殖系统的损伤机制奠定了实验基础,对小反刍兽疫防控具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
【关键词】：小反刍兽疫病毒 山羊子宫内膜上皮细胞 荧光定量PCR 增殖规律 Western blot法
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 文献综述11-21
• 第一章 小反刍兽疫概述11-21
• 1.1 病原学11-12
• 1.2 分子生物学研究12
• 1.3 病毒的蛋白及其功能12-15
• 1.3.1 M蛋白12
• 1.3.2 N蛋白12-13
• 1.3.3 F蛋白（融合蛋白）13
• 1.3.4 H蛋白（血凝素-神经氨酸酶）13
• 1.3.5 L蛋白（大蛋白）13-14
• 1.3.6 P蛋白（磷蛋白）14
• 1.3.7 非结构蛋白14-15
• 1.4 流行病学15-16
• 1.4.1 易感动物15
• 1.4.2 地理分布15-16
• 1.5 临床特征及发病机理16-17
• 1.5.1 临床症状16
• 1.5.2 发病机理16-17
• 1.6 诊断方法17-18
• 1.6.1 病毒分离17
• 1.6.2 酶联免疫吸附实验17-18
• 1.6.3 RT-PCR检测18
• 1.7 疾病防治18-19
• 1.8 展望19-21
• 试验研究21-38
• 第二章 实时荧光定量PCR检测PPRV方法的建立21-31
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 细胞和病毒21
• 2.1.2 菌株和载体21
• 2.1.3 主要试剂21
• 2.1.4 主要仪器21-22
• 2.1.5 常用试剂及溶液的配制22
• 2.2 方法22-26
• 2.2.1 病毒增殖22-23
• 2.2.2 引物设计23
• 2.2.3 提取RNA23
• 2.2.4 重组质粒的构建23-25
• 2.2.4.1 RT-PCR反转录23
• 2.2.4.2 PCR扩增23-24
• 2.2.4.3 PCR产物的胶回收24
• 2.2.4.4 产物的连接24
• 2.2.4.5 大肠杆菌感受态细胞的转化24
• 2.2.4.6 重组质粒的提取24-25
• 2.2.4.7 重组质粒的菌液PCR鉴定及测序25
• 2.2.4.8 计算重组质粒拷贝数25
• 2.2.5 定量PCR方法的建立25
• 2.2.5.1 扩增曲线25
• 2.2.5.2 溶解曲线25
• 2.2.5.3 标准曲线25
• 2.2.6 荧光定量PCR方法评价25-26
• 2.2.6.1 特异性验证25
• 2.2.6.2 敏感性验证25-26
• 2.2.6.3 重复性验证26
• 2.3 结果26-29
• 2.3.1 PCR结果26
• 2.3.2 重组质粒PCR鉴定结果26-27
• 2.3.3 基因序列测定分析27
• 2.3.4 计算拷贝数27
• 2.3.5 扩增曲线的建立27
• 2.3.6 标准曲线的建立27-28
• 2.3.7 溶解曲线分析28
• 2.3.8 荧光定量PCR方法的评价28-29
• 2.3.8.1 特异性验证28
• 2.3.8.2 敏感性分析28-29
• 2.3.8.3 重复性验证29
• 2.4 讨论29-31
• 第三章小反刍兽疫病毒N75-1 株在EEC细胞上的增殖特性31-38
• 3.1 材料31-33
• 3.1.1 细胞和病毒31
• 3.1.2 主要试剂31
• 3.1.3 主要溶液的配制31-32
• 3.1.4 主要仪器32-33
• 3.2 方法33-35
• 3.2.1 EEC细胞的培养及病毒的增殖33
• 3.2.1.1 EEC细胞培养33
• 3.2.1.2 小反刍兽疫N75-1 疫苗毒株扩增培养33
• 3.2.2 N75-1 TCID50的测定33-34
• 3.2.3 EEC细胞接种疫苗毒N75-1 与病毒增殖定量PCR检测34
• 3.2.3.1 PPRV接种EEC细胞定量PCR样品收集34
• 3.2.3.2 定量PCR检测34
• 3.2.4 N75-1 疫苗毒株感染EEC细胞后N蛋白表达检测34-35
• 3.3 结果35-36
• 3.3.1 EEC细胞接毒前后CPE观察35
• 3.3.2 PPRV感染EEC细胞后TCID50的测定35
• 3.3.3 PPRV感染EEC细胞后增殖规律35-36
• 3.3.4 PPRV感染EEC细胞后N蛋白表达规律36
• 3.4 讨论36-38
• 结论38-39
• 参考文献39-43
• 缩略词表43-44
• 致谢44-45
• 作者简介45

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本文编号：542096