伽氏疏螺旋体P66基因的特征与抗原性研究

发布时间：2017-07-18 14:36

  本文关键词：伽氏疏螺旋体P66基因的特征与抗原性研究

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【摘要】：莱姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu lato)感染引起的主要经蜱传播的自然疫源性人兽共患病。莱姆病在全世界范围内流行,已经成为一种全球性的对人类健康造成严重危害的虫媒传染病。(1)本研究对采自8个省份的849份蜱(5属,7种)提取全基因组,基于鞭毛蛋白基因(fla)通过套式PCR(nested polymerase chain reaction)法进行伯氏疏螺旋体的检测。结果表明,不同地区的蜱体内均携带病原,平均感染阳性率为18.4%(156/849,95%CI=12.8-42.5%),在1.8%~77.4%之间。鞭毛蛋白基因序列和系统进化分析显示,有4种基因型的伯氏疏螺旋体病原:伽氏疏螺旋体(B.garinii)、狭义伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi sensu stricto)、阿氏疏螺旋体(B.afzelii)、美洲疏螺旋体(B.americana)以及一个未定种(Borrelia sp.)存在,并在我国首次报道了美洲疏螺旋体(B.americana)。(2)P66是由伯氏疏螺旋体染色体编码的外膜蛋白,分子量约为66 ku。目前的研究表明,伯氏疏螺旋体P66蛋白主要有两种功能:一是可作为一种黏附分子,结合β3整合蛋白;二是可作为外膜孔通道蛋白发挥作用。本研究根据已获得的伽氏疏螺旋体尚志株(B.garinii SZ)的全基因组数据,克隆P66基因编码的开放阅读框。结果显示,PCR扩增获得P66基因的完整ORF(1866 bp),编码621个氨基酸,分子量为68.4 ku。生物信息学分析显示,1-21氨基酸为信号肽序列,二级结构以α螺旋和β折叠为主。系统进化分析显示,伽氏疏螺旋体尚志株的P66基因与GenBank公布的伽氏疏螺旋体(美国-PBr株和德国-Pbi株)分布在同一个分支上,表明获得的P66基因是正确的。(3)以上述获得的P66基因片段为模板,设计引物并扩增获得部分P66基因。将目的片段连接表达载体pET-30a(+),转化表达菌BL21(DE3),经PCR、双酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达与纯化;将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,获得约70 ku的表达产物。Western-blot分析表明表达产物能够与抗His标签的小鼠单克隆抗体、螺旋体感染鼠源阳性血清、兔抗P66多克隆抗体均能发生反应。抗rP66蛋白的多克隆抗体也可识别天然蛋白。(4)收集体外培养的伽氏疏螺旋体尚志株的菌液以皮下注射的方式感染BLAB/c小鼠,在感染后不同时间点收集小鼠脏器,并提取组织总RNA,获得第一链cDNA;设计针对P66基因的Real-time PCR引物,内参为鞭毛蛋白(flaB)基因,评价P66基因在宿主感染不同阶段的表达丰度。结果表明,P66基因在感染宿主后不同时间、不同组织中的表达变化规律不明显,但是脑组织中表达量的变化较为明显,间接说明P66基因与伽氏疏螺旋体的致病性相关。以上研究结果显示,通过对伽氏疏螺旋体尚志株P66基因的生物信息学分析,蛋白的克隆及原核表达,制备多克隆抗体,验证了抗体对天然蛋白的识别性,以及Real-time PCR对P66基因在宿主感染后不同阶段的表达丰度变化的评价,表明P66基因与伽氏疏螺旋体的致病性相关。
【关键词】：伽氏疏螺旋体尚志株 媒介蜱 P66基因 原核表达 Real-time PCR
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.63
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-14
• 英文缩略表14-15
• 第一章 引言15-23
• 1.1 病原体15
• 1.2 生活史15-16
• 1.3 流行病学16-18
• 1.3.1 地理分布16-17
• 1.3.2 传播媒介17
• 1.3.3 储存宿主17-18
• 1.4 致病机制与致病相关蛋白18-20
• 1.5 临床症状20
• 1.6 诊断方法20-21
• 1.6.1 病原学检测20-21
• 1.6.1.1 病原的直接检测20
• 1.6.1.2 病原的分离培养20-21
• 1.6.2 血清学检测21
• 1.6.3 分子生物学检测21
• 1.6.4 新的检测方法21
• 1.7 P66基因的研究21-22
• 1.8 研究的目的与意义22-23
• 第二章 我国部分地区的蜱体内伯氏疏螺旋体的调查23-33
• 2.1 材料23-24
• 2.1.1 实验菌株23
• 2.1.2 野外样品收集23
• 2.1.3 试剂23
• 2.1.4 仪器设备23-24
• 2.2 方法24-29
• 2.2.1 引物的设计和合成24
• 2.2.2 伽氏疏螺旋体尚志株的培养24-25
• 2.2.3 蜱样品的采集及鉴定25
• 2.2.4 DNA提取25-26
• 2.2.4.1 伽氏疏螺旋体尚志株DNA的提取25-26
• 2.2.4.2 蜱DNA的提取26
• 2.2.5 样品的PCR检测26-27
• 2.2.6 PCR阳性产物纯化与回收27-28
• 2.2.7 目的基因片段的克隆与测序28
• 2.2.7.1 目的片段与载体的连接28
• 2.2.7.2 连接产物的转化28
• 2.2.7.3 挑斑摇菌和检测28
• 2.2.8 序列和数据分析28-29
• 2.3 结果29-31
• 2.3.1 蜱体内伯氏疏螺旋体的检测29
• 2.3.2 序列和系统进化分析29-31
• 2.4 讨论31-33
• 第三章 伽氏疏螺旋体尚志株P66基因生物信息学分析33-44
• 3.1 材料33
• 3.1.1 实验菌株33
• 3.1.2 试剂33
• 3.1.3 仪器设备33
• 3.2 方法33-36
• 3.2.1 伽氏疏螺旋体尚志株的培养33
• 3.2.2 伽氏疏螺旋体尚志株总RNA的提取33-34
• 3.2.3 反转录合成第一链cDNA34
• 3.2.4 引物的设计和合成34-35
• 3.2.5 P66基因全长序列的扩增35
• 3.2.6 PCR产物胶回收35
• 3.2.7 胶回收产物的连接、转化和测序35-36
• 3.2.7.1 胶回收产物的连接35-36
• 3.2.7.2 连接产物的转化36
• 3.2.7.3 挑斑摇菌和检测36
• 3.2.8 生物信息学分析36
• 3.3 结果36-42
• 3.3.1 伽氏疏螺旋体尚志株P66基因全长的扩增36-37
• 3.3.2 伽氏疏螺旋体尚志株P66基因的进化关系37-38
• 3.3.3 P66蛋白的生理学和生物化学特征分析38-40
• 3.3.4 P66蛋白的亲/疏水性和二级结构预测40
• 3.3.5 P66蛋白的功能域和信号肽预测40-41
• 3.3.6 P66蛋白的B细胞和T细胞抗原表位预测41-42
• 3.4 讨论42-44
• 第四章 伽氏疏螺旋体尚志株P66基因的原核表达及多克隆抗体的制备44-54
• 4.1 材料44
• 4.1.1 实验菌株及实验动物44
• 4.1.2 试剂44
• 4.1.3 仪器设备44
• 4.2 方法44-48
• 4.2.1 引物的设计和合成44-45
• 4.2.2 目的基因PCR扩增45
• 4.2.3 PCR产物的目的片段胶回收45
• 4.2.4 胶回收产物的连接、转化和测序45-46
• 4.2.4.1 胶回收产物的连接45-46
• 4.2.4.2 连接产物的转化46
• 4.2.4.3 挑斑摇菌和检测46
• 4.2.5 质粒提取46
• 4.2.6 原核表达载体的构建46-47
• 4.2.6.1 克隆质粒与表达载体的双酶切46
• 4.2.6.2 目的片段和表达载体的连接46-47
• 4.2.6.3 转化、挑斑和摇菌47
• 4.2.6.4 重组质粒的鉴定47
• 4.2.7 重组质粒的的原核表达47
• 4.2.8 重组蛋白的纯化47-48
• 4.2.9 兔源抗体的制备、特异性及抗体效价的测定48
• 4.2.10 多克隆抗体对天然蛋白的识别48
• 4.3 结果48-52
• 4.3.1 P66基因的扩增48-49
• 4.3.2 重组质粒的双酶切鉴定49-50
• 4.3.3 重组蛋白的表达及纯化50
• 4.3.4 重组蛋白的免疫原性分析50-51
• 4.3.5 天然蛋白的识别与鉴定分析51-52
• 4.4 讨论52-54
• 第五章 伽氏疏螺旋体尚志株P66基因在宿主中的差异表达分析54-62
• 5.1 材料54
• 5.1.1 实验菌株及实验动物54
• 5.1.2 试剂54
• 5.1.3 仪器设备54
• 5.2 方法54-56
• 5.2.1 伽氏疏螺旋体尚志株的培养54
• 5.2.2 动物实验54-55
• 5.2.3 小鼠脏器的收集55
• 5.2.4 组织总RNA的提取55
• 5.2.5 反转录合成第一链cDNA55
• 5.2.6 引物设计和合成55-56
• 5.2.7 实时荧光定量PCR反应56
• 5.3 结果56-60
• 5.3.1 P66基因在同一组织不同时间点的表达丰度56-58
• 5.3.2 P66基因在同一时间点不同组织中的表达丰度58-60
• 5.4 讨论60-62
• 第六章 全文结论62-63
• 参考文献63-69
• 致谢69-70
• 作者简历70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 曹有祥,张习坦,马静,张永国,钱金泉,魏国华;从新疆全沟硬蜱中分离出莱姆病病病原体的报告[J];地方病通报;1988年04期

，

本文编号：558209