猪圆环病毒2型微滴式数字PCR检测方法的建立与初步应用

发布时间：2017-07-18 20:16

  本文关键词：猪圆环病毒2型微滴式数字PCR检测方法的建立与初步应用

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【摘要】：猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,1991年首次发现于加拿大。PMWS临床特征主要有断奶仔猪呼吸困难、腹泻、黄疸、明显的淋巴组织病变和进行性消瘦。猪场中PCV2感染率高,建立灵敏而快速的分子诊断方法有助于对该疾病进行早期诊断,有助于控制PCV2的传播,有助于种猪进出口时快速灵敏地进行病原体的检验检疫。本研究建立了一种新型的、灵敏的并且操作简单的PCV2微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)定量检测方法,将其应用于检测种猪血清样品、猪内脏组织、PCV2疫苗半成品中PCV2病毒含量的情况,并与TaqMan荧光定量PCR (TaqMan flurogenic quantitative PCR, qPCR)方法进行比较验证,获得满足出入境检验检疫需求的猪圆环病毒高效灵敏的检疫方法。本研究主要内容及结果如下：1.PCV2ddPCR检测方法的建立根据PCV2中国株(ZJG1103)的基因全长,设计PCR扩增引物,并成功扩增出全基因组,通过连接与转化后,将全基因构建到pMD19-T载体上,成功制备了PCV2重组质粒标准品pMD-PCV2。根据GenBank中登录的PCV2 ORF2基因序列(KC823059.1),设计并合成一对特异性引物及探针,在进行引物探针浓度和PCR退火温度的优化后,分别建立了PCV2的qPCR和ddPCR检测方法。两种方法的线性关系试验表明,在9.85×105-12.5拷贝／μL的检测范围内,ddPC R与qPCR均具有良好的线性关系(R2=～1),当质粒标准品被稀释到108倍以下时,qPCR已无明显的扩增曲线,而ddPCR乃可检测到具有荧光信号的阳性微滴,其最低检测极限约25拷贝/μL,敏感性比qPCR高4倍,ddPCR表现出更宽的动态检测范围。利用建立的PCV2ddPCR方法检测PCV1、PRV、PPV、PRRSV和CSFV的核酸,结果均呈阴性,表明该方法特异性强,检测结果可靠。重复性试验中,组内试验和组问试验变异系数(CV%)均小于3%,表明建立的ddPCR检测方法重复性好且稳定性高,可用于后期检测临床样品。2. PCV2 ddPCR检测方法的初步应用用本研究建立的ddPCR检测107份来自疑似发病猪场的种猪血清样品,ddPCR和qPCR的核酸阳性检出率分别为84.1%和80.4%。Kappa分析比较两种方法的实验结果,Kappa系数为0.89(SE=0.06,95%置信区间),表明两种检测方法之间有良好的符合率。另外,用建立的PCV2 ddPCR和qPCR方法检测猪内脏组织样品,核酸阳性检出率分别为41.7%和29.2%,ddPCR表现出更高的灵敏度。最后,用ddPCR和qPCR方法分别检测PCV2疫苗半成品中的病毒含量,ddPCR定量检测结果与传统的TCID50方法测定的结果更一致。因此,本研究建立的ddPCR检测方法可以用于多种临床样品PCV2的定量检测。
【关键词】：检测 微滴式数字PCR 猪圆环病毒2型 TaqMan荧光定量PCR
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 缩略词表9-14
• 第一章 文献综述14-26
• 1 PCV的病原学特征14-16
• 1.1 PCV的发现14-15
• 1.2 PCV形态及理化特性15
• 1.3 培养特性15
• 1.4 PCV基因组结构特征15-16
• 1.5 PCV的复制16
• 2 PCV2的致病机制16-17
• 3 PCV2的流行及相关疾病17-19
• 3.1 PCV2的流行情况17
• 3.2 PCV2的相关疾病17-19
• 3.2.1 断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)17-18
• 3.2.2 猪皮炎与肾病综合征(PDNS)18
• 3.2.3 增生和坏死性肺炎(PNP)18
• 3.2.4 繁殖障碍病(Reproductive failure)18
• 3.2.5 仔猪先天性震颤(CT)18-19
• 4 PCV2的实验室检测技术研究进展19-23
• 4.1 PCV2免疫学诊断方法19-20
• 4.1.1 免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)19
• 4.1.2 间接免疫荧光技术(Immunofluorescence assay,IFA)19
• 4.1.3 过氧化物酶单层试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)19-20
• 4.1.4 酶联免疫吸附技术(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)20
• 4.2 分子生物学诊断技术20-23
• 4.2.1 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)20-22
• 4.2.2 限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism,RFLP)22
• 4.2.3 核酸环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)22-23
• 4.2.4 原位杂交技术(Nucleic acid probe and in situ hybridization,ISH)23
• 4.2.5 基因芯片技术23
• 5 微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR,ddPCR)23-25
• 5.1 技术原理及优势24
• 5.2 研究进展24-25
• 6 研究目的与意义25-26
• 第二章 猪圆环病毒2型微滴式数字PCR检测方法的建立26-43
• 1 实验材料26-27
• 1.1 实验仪器26-27
• 1.2 主要试剂27
• 1.3 实验样品27
• 2 实验方法27-33
• 2.1 引物和探针的设计与合成27-28
• 2.2 病毒核酸的提取28
• 2.3 RNA反转录28-29
• 2.4 重组质粒标准品的制备29-30
• 2.4.1 目的片段的扩增29
• 2.4.2 目的片段的回收与纯化29
• 2.4.3 纯化产物连接与转化29
• 2.4.4 感受态细胞的制备29-30
• 2.5 qPCR检测条件的确定30
• 2.6 ddPCR检测方法的建立30-33
• 2.6.1 ddPCR的工作流程30-31
• 2.6.2 ddPCR反应条件的优化31-32
• 2.6.3 标准曲线的建立及对比32
• 2.6.4 特异性试验32
• 2.6.5 敏感性试验32
• 2.6.6 重复性试验32-33
• 3 结果33-41
• 3.1 重组质粒标准品的制备33
• 3.2 qPCR反应条件的优化33-35
• 3.2.1 退火温度优化33-34
• 3.2.2 引物浓度优化34
• 3.2.3 探针浓度优化34-35
• 3.3 ddPCR反应条件的优化35-37
• 3.3.1 退火温度优化35-36
• 3.3.2 引物浓度的优化36
• 3.3.3 探针浓度的优化36-37
• 3.4 ddPCR与qPCR标准曲线的建立及对比37-38
• 3.5 特异性试验38-39
• 3.6 敏感性试验39-40
• 3.7 重复性试验40-41
• 4 分析与讨论41-42
• 5 小结42-43
• 第三章 猪圆环病毒2型微滴式数字PCR检测方法的初步应用43-51
• 1 材料和方法43-46
• 1.1 临床样品采集43
• 1.2 主要试剂及耗材43-44
• 1.3 主要实验仪器44
• 1.4 实验方法44-46
• 1.4.1 组织样品处理44
• 1.4.2 病毒DNA提取44-45
• 1.4.3 ddPCR检测方法临床应用45-46
• 2 结果46-48
• 2.1 临床血清样品检测46-47
• 2.2 不同脏器组织中PCV2含量检测47
• 2.3 PCV2疫苗半成品病毒含量检测47-48
• 3 分析与讨论48-50
• 4 小结50-51
• 结论与创新点51-52
• 1 结论51
• 2 创新点51-52
• 参考文献52-59
• 致谢59-60
• 攻读学位期间发表的学术论文目录60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨泽晓;侯义宏;曾辉;姚学萍;王印;刘红亮;刘波;邬旭龙;彭彬;;猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立与应用[J];中国兽医科学;2014年02期

2 魏津;蒋卉;戴志红;关孚时;李翠;张秀英;温芳;陆连寿;王在时;;高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)病毒含量荧光定量PCR方法的建立[J];中国兽药杂志;2013年10期

3 董林;王艳萍;魏凤;唐娜;沈志强;柳增善;;猪圆环病毒2型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立[J];中国兽医学报;2013年10期

4 李晓琳;郭华;刘子臣;段滇宁;张亚群;韩俊源;张书霞;;PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞TLRs的影响[J];南京农业大学学报;2013年05期

5 朱强远;杨文秀;高一博;于丙文;邱琳;周超;金伟;金钦汉;牟颖;;一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片[J];高等学校化学学报;2013年03期

6 柳方方;张玲;王晶;陈大舟;臧超;于笑波;秦培勇;;数字PCR测定DNA含量及测量结果不确定度评定[J];化学分析计量;2013年01期

7 林彩琴;姚波;;数字PCR技术进展[J];化学进展;2012年12期

8 刘雯;李勇;张宁;马丽敏;李琳;胡乐鹏;靳朝;夏志平;;猪圆环病毒2型原位杂交检测方法的建立[J];中国兽医学报;2012年01期

9 刘长海;;实时荧光定量PCR技术研究进展及应用[J];中国实用医药;2011年31期

10 车勇良;庄向生;石运通;王隆柏;魏宏;陈如敬;吴学敏;周伦江;;猪圆环病毒2型间接ELISA方法的建立[J];中国农学通报;2011年07期

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本文编号：559608