鸭源cathelicidin的分子克隆及体外生物学功能研究

发布时间：2017-07-20 23:05

  本文关键词：鸭源cathelicidin的分子克隆及体外生物学功能研究

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【摘要】：Cathelicidin是广泛存在于脊椎动物体内的一类抗微生物多肽,整个肽包括信号肽、高度保守的cathelin域和功能肽,因其具有独特的结构特点在整个抗菌肽家族中单独形成一支。目前,哺乳动物、鱼类、两栖动物、鸟类等均有cathelicidin的发现,且越来越多的cathelicidin正在被发现与研究。研究证明,cathelicidin除了具有高效广谱抑菌活性外、还具有免疫调节活性,是机体免疫体系不可或缺的一部分,同时cathelicidin还具有抑制组织损伤并促进伤口愈合、促进血管生成、结合内毒素等功能,具有广阔的研究价值与应用前景。在本试验中,以绍鸭为试验对象,通过基因克隆的方法首次获得了鸭源cathelicidin抗菌肽基因编码全序列,并对该肽dCATH的序列特点与系统发育学、体外生物学活性、二级结构、作用机制等进行了研究与探讨。根据原鸡、鹌鹑、环颈雉、鸽子等禽类cathelicidin基因的序列结构特点,设计一系列特异性引物,采用3'RACE-PCR的方法获得了鸭cathelicidin的全基因编码序列,整个开发阅读框为441 bp,编码146个氨基酸,由17个氨基酸的信号肽、98个氨基酸的cathelin域和20个氨基酸的功能多肽组成,其中预测的功能肽d CATH序列为KRFWQLVPLAIKIYRAWKRR。通过序列对比与进化树分析获知,dCATH与其他禽源物种的cathelicidin前体肽具有较高的同源性,但功能肽差异较大,表明dCATH基因在进化过程中与其他禽源cathelicidin基因具有一定亲缘关系,可能来自于一个共同的祖先,而功能肽的差异可能因为不同的物种面临的病原微生物不同,而向着不同的方向进化。CD圆二色谱测定d CATH以α螺旋结构为主。抑菌试验表明d CATH对8种代表性测试菌具有高效的杀菌活性,平均MICs为4μM,对大肠杆菌MIC值甚至达到2μM。d CATH对哺乳动物细胞的损伤作用通过人红细胞和Ha Cat细胞检测,发现d CATH在低浓度下,毒性较小,随着浓度增加,肽对哺乳动物细胞的损伤程度也大幅度增强,但是,培养基中加入10%胎牛血清会明显降低肽的溶血活性。d CATH具有良好的盐离子和热稳定性,阳离子和高温处理对肽的活性影响极小;但是酶稳定性稍弱,试验中选定的四种酶均会影响肽的活性,其中在木瓜蛋白酶和蛋白酶K处理后,d CATH的MIC128μM。d CATH的抑菌机制的研究主要集中在细菌胞膜上,通过内外膜通透性、内膜去极化、扫描与透射电子显微镜等试验,发现d CATH同大多数肽一样,能够改变内外膜的通透性,使胞内物质外流,从而达到杀死细菌的目的。
【关键词】：鸭 Cathelicidin 基因克隆 抑菌活性 抑菌机制
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 引言11-21
• 1.1 抗菌肽的研究进展11-14
• 1.1.1 抗菌肽的概述11-12
• 1.1.2 抗菌肽的分类12
• 1.1.3 抗菌肽的生物学功能12-13
• 1.1.4 抑菌机制13
• 1.1.5 抗菌肽的应用前景13-14
• 1.2 Cathelicdin类抗菌肽的研究进展14-19
• 1.2.1Cathelicidins的结构特点14-15
• 1.2.2 Cathelicidins的表达与合成调控15-16
• 1.2.3 Cathelicidins的生物学功能16-17
• 1.2.4 Cathelicidins在医疗保健中的应用前景17
• 1.2.5 禽cathelicidins的研究进展17-19
• 1.3 研究目的意义与研究内容19-21
• 1.3.1 研究目的与意义19
• 1.3.2 研究内容19-21
• 2 材料与方法21-34
• 2.1 鸭源肽的基因克隆21-26
• 2.1.1 材料21-22
• 2.1.2 组织总RNA的提取22-23
• 2.1.3 cDNA文库的构建23
• 2.1.4 聚合酶链式反应（PCR）23-24
• 2.1.5 PCR产物的回收24
• 2.1.6 PCR产物与T载体连接24
• 2.1.7 连着产物的转化24-25
• 2.1.8 PCR鉴定阳性重组子25
• 2.1.9 3'RACE巢氏PCR反应体系25-26
• 2.2 鸭子抗菌肽的鉴定及结构分析26-27
• 2.2.1 鸭源cathelicidin成熟肽(dCATH)的预测26
• 2.2.2 鸭cathelicidin进化树分析26-27
• 2.3 dCATH 的生物学活性与二级结构27-30
• 2.3.1 材料27-28
• 2.3.2 肽的合成与溶解28
• 2.3.3 抑菌活性测定28
• 2.3.4 溶血活性测定28-29
• 2.3.5 细胞毒性测定29
• 2.3.6 稳定性29-30
• 2.3.7 圆二色光谱（CD）30
• 2.4 抗菌肽的抑菌机理30-33
• 2.4.1 材料30-31
• 2.4.2 细胞膜的完整性与通透性31-32
• 2.4.3 扫描电子显微镜的观察32
• 2.4.4 透射电子显微镜观察32-33
• 2.5 数据分析33-34
• 3 结果与分析34-45
• 3.1 鸭源肽的克隆34-38
• 3.1.1 RNA与PCR产物质量检测34-35
• 3.1.2 测序结果分析及功能序列的确立35-36
• 3.1.3 dCTAH的同源性与进化树分析36-38
• 3.2 肽的活性与二级结构38-41
• 3.2.1 抑菌活性38
• 3.2.2 肽的溶血与细胞毒性38-39
• 3.2.3 稳定性39-41
• 3.2.4 dCATH的二级结构分析41
• 3.3 作用机理41-45
• 3.3.1 外膜通透性测定41-42
• 3.3.2 内膜通透性与内膜去极化42-43
• 3.3.3 扫描与透射43-45
• 4 讨论45-50
• 4.1 dCATH序列的确立及进化分析45-46
• 4.2 dCATH的生物学活性与结构46-48
• 4.2.1 抑菌活性46
• 4.2.2 肽结构46
• 4.2.3 肽的毒性46-47
• 4.2.4 稳定性47-48
• 4.3 作用机理48-50
• 4.3.1 膜的通透性与去极化48
• 4.3.2 电镜观察48-50
• 5 结论50-51
• 致谢51-52
• 参考文献52-60
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文60

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本文编号：570372