禽致病性大肠杆菌的分离鉴定与O1、O2、O78菌株lpxL、lpxM基因缺失灭活疫苗的初步研究

发布时间：2017-07-20 23:06

  本文关键词：禽致病性大肠杆菌的分离鉴定与O1、O2、O78菌株lpxL、lpxM基因缺失灭活疫苗的初步研究

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【摘要】：禽致病性大肠杆菌主要引起禽类的心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎、腹膜炎等,并导致不同程度死亡率,给养殖业造成严重的经济损失。本研究采集江苏地区疑似大肠杆菌病的病鸡的组织进行大肠杆菌的分离鉴定,探究其致病性、耐药性；随后进行基因缺失多价灭活疫苗免疫保护效果的研究。为禽大肠杆菌病的防治提供理论依据,同时为多价灭活疫苗的研发奠定基础。一禽致病性大肠杆菌的分离鉴定及致病性研究本研究对江苏省部分地区疑似大肠杆菌病的病死鸡进行大肠杆菌的分离与鉴定,共分离鉴定了162株大肠杆菌。通过玻板凝集和试管凝集试验对大肠杆菌分离株进行O血清型鉴定,其中定型菌株130株,未定型菌株32株,定型率为80.25%。在130株定型菌株中鉴定出34种O血清型,其中主要血清型有O78、O88、O65、O161、O1、O24、O13,占定型菌株的66.92%。通过PCR方法对分离到的162株大肠杆菌进行iss、iroN、tsh、cvaC、 iutA及irp26个与禽致病性大肠杆菌致病力密切相关的毒力基因的检测,其检出率分别为83.33%、80.86%、45.06%、48.76%、75.92%、58.02%,同时携带6个毒力基因的菌株有37株,占总分离菌株的22.83%。选取本研究分离鉴定的菌株64株(主要血清型45株)进行1日龄易感鸡的致病性试验,结果64个分离株中有55株属于高中致病性菌株,占85.94%。其中,高致病性菌株40株(主要血清型33株),中度致病性菌株15株(主要血清型8株),低致病性菌株9株。通过1日龄致病性试验并结合6个与禽致病性大肠杆菌致病力密切相关的毒力基因的检测,可以判定本研究分离菌中至少有80%的分离菌具有中高致病力。二禽致病性大肠杆菌耐药性研究本研究选取了16种抗生素(氨苄青霉素、四环素、强力霉素、先锋霉素V、磺胺异VA唑、链霉素、庆大霉素、环丙沙星、卡那霉素、左旋氧氟沙星、氟苯尼考、新霉素、阿奇霉素、诺氟沙星、多粘菌素B、环丙沙星)对60个分离株进行药物敏感性的筛选。60个分离株对强力霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺异嗯唑及环丙沙星的耐药率在80%及以上；对阿奇霉素、庆大霉素及多粘菌素B的耐药率在50%以下；对多粘菌素B的敏感性最高。60个分离株均出现不同程度的多重耐药情况。其中,受检菌株中耐13种药物的菌株最多,占总受检菌株的25.0%(15/60)；有63.33%(38/60)的受检菌株对9种及以上药物耐药。由此可知目前禽致病性大肠杆菌的耐药性严重且耐药谱比较广。三禽致病性大肠杆菌01、02、078菌株lpxL、lpxM基因缺失灭活疫苗的初步研究本研究利用本实验室保存的01、02、078血清型的野生株及其lpxL、lpxM突变株制备油佐剂多价灭活疫苗,免疫后对其特异性抗体反应水平、对野生株的攻毒保护率及免疫鸡内脏组织的病理变化进行研究。研究数据显示,本研究制备的疫苗的血清特异性抗体水平与攻毒保护率均优于商品疫苗组,突变株疫苗的安全性和免疫应激性优于野生株疫苗。不同佐剂对疫苗免疫保护效果的影响：突变株Montanide TSA 71VG佐剂疫苗组的特异性抗体水平与保护率优于白油佐剂疫苗；对01、02、078毒株的保护率：突变株Montanide TSA 71VG佐剂疫苗分别为86.67%、93.33%及100%,白油佐剂疫苗分别为对80%、86.67及86.67。不同免疫次数对免疫保护效果的影响：将突变株Montanide TSA 71VG佐剂疫苗对鸡进行一次免疫后攻毒,其免疫保护率要优于商品疫苗的二次免疫的免疫保护率,与突变株Montanide TSA 71VG佐剂疫苗二次免疫组相比保护率相当,对血清型01、02、078毒株的免疫保护率分别为80%、93.33%、93.33%。因此,本研究制备的突变株Montanide TSA71VG佐剂疫苗免疫一次就足够抵抗大肠杆菌01、02、078的感染,其保护率远远高于商品疫苗免疫组。
【关键词】：禽致病性大肠杆菌 血清型 药敏试验 毒力基因 致病性 灭活疫苗
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 符号说明11-12
• 第一章 文献综述12-32
• 综述一 禽致病性大肠杆菌的研究进展12-21
• 1 病原学12-14
• 2 流行病学14-15
• 3 禽致病性大肠杆菌毒力因子的研究15-17
• 4 发病机理17-18
• 5 临床症状及病理变化18-20
• 6 防治20-21
• 综述二 鸡大肠杆菌疫苗的研究进展21-25
• 1 灭活疫苗21-23
• 2 亚单位疫苗23-24
• 3 弱毒菌苗24-25
• 参考文献25-32
• 第二章 禽致病性大肠杆菌的分离鉴定、抗药性及致病性研究32-48
• 1 材料32-33
• 1.1 病料来源32
• 1.2 培养基及其配制方法32
• 1.3 主要仪器和设备32-33
• 1.4 试剂33
• 1.5 实验动物33
• 2 方法33-37
• 2.1 细菌的分离培养33
• 2.2 细菌的纯化与保存33-34
• 2.3 细菌的实验室鉴定34
• 2.4 分离株O血清型的鉴定34-35
• 2.5 分离株毒力基因的检测35-37
• 2.6 分离株致病性试验37
• 2.7 药敏试验37
• 3 结果37-44
• 3.1 细菌的分离培养37-38
• 3.2 细菌的形态学观察38
• 3.3 生化试验结果38
• 3.4 分离株O血清型鉴定38-41
• 3.5 分离株毒力基因的PCR检测结果41
• 3.6 分离株的致病性试验41-42
• 3.7 分离株药物敏感性试验结果42-44
• 3.8 大肠杆菌的多重耐药性44
• 4 小结与讨论44-47
• 参考文献47-48
• 第三章 大肠杆菌多价灭活疫苗的初步研究48-62
• 1 材料48-49
• 1.1 制苗菌株48
• 1.2 常用培养基及其配制方法48
• 1.3 主要仪器和设备48
• 1.4 主要试剂48-49
• 1.5 实验动物49
• 1.6 商品疫苗49
• 2 方法49-52
• 2.1 灭活疫苗抗原的制备49
• 2.2 油佐剂灭活苗的制备49-50
• 2.3 疫苗质量检查50
• 2.4 疫苗的接种与攻毒保护试验50-51
• 2.5 间接ELISA方法检测血清中特异性抗体水平51-52
• 2.6 病理切片的制备52
• 3 结果52-59
• 3.1 突变株与野生株高剂量疫苗对免疫鸡的影响52
• 3.2 Montanide TSA 71VG佐剂疫苗两次免疫的保护效果52-54
• 3.3 两种不同佐剂突变株疫苗两次免疫的免疫效果比较54-56
• 3.4 突变株Montanide TSA 71VG佐剂疫苗与商品疫苗的免疫比较56-58
• 3.5 病理切片58-59
• 4 小结与讨论59-61
• 参考文献61-62
• 全文总结62-63
• 致谢63-64

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