酿酒酵母菌诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1表达及其信号通路初步研究

发布时间：2017-07-27 01:11

  本文关键词：酿酒酵母菌诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1表达及其信号通路初步研究

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【摘要】：防御素(Defensins)是生物界中发现的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗菌肽,具有广谱的抗微生物活性,在生物体的免疫反应中发挥着重要的作用。本研究选用益生性酿酒酵母菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞(Ruminal Epithelial Cells, RECs)p-防御素-1(Sheep-Beta-Defensin-1, SBD-1)表达的影响及其可能的信号转导途径。首先建立绵羊RECs培养体系作为体外试验模型,用不同浓度酿酒酵母菌对体外培养的绵羊RECs刺激2 h后分别进行不同时间的诱导培养,利用实时荧光定量逆转录PCR技术(Realtime fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)和酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试验研究接受刺激后RECs SBD-1 mRNA和蛋白表达的差异,以确定酿酒酵母菌对SBD-1表达影响的量效和时效关系。然后选用诱导SBD-1表达最高的菌液浓度和诱导培养时间进行后续的信号通路初步研究,采用核因子-kB (Nuclear.factor-kappa B, NF-kB)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)的4种特异性抑制剂通过单独或组合对各通路中的关键因子进行抑制,利用RT-qPCR技术检测抑制前后SBD-1 mRNA的表达量及其信号通路中各因子在酿酒酵母菌刺激前后(TLR-2、MyD88、NF-kB、P38、 JNK、ERK1/2) mRNA的表达变化。结果表明：无论在mRNA还是蛋白水平,酿酒酵母菌均能够诱导绵羊RECsSBD-1的表达,且菌液浓度为5.2×107CFU·mL-1诱导培养RECs 12 h时,SBD-1的表达量达到最高。4种特异性抑制剂无论是单独还是组合对各通路进行抑制,其抑制效果依次表现为SB202190 PDTC SP600125 PD98059,且信号通路中各因子mRNA在酿酒酵母菌刺激后均有变化。因此,酿酒酵母菌诱导绵羊RECs SBD-1的表达可能与TLR2-MyD88-NF-kB/MAPKs通路有关,但可能以TLR2-MyD88-MAPKs中的TLR2-MyD88-P38通路为主。
【关键词】：β-防御素-1 瘤胃上皮细胞 酿酒酵母菌 实时荧光定量PCR 酶联免疫吸附测定 抑制剂 信号通路 绵羊
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 缩略语表10-11
• 1 引言11-19
• 1.1 抗菌肽11
• 1.2 防御素11-12
• 1.3 β-防御素12-13
• 1.3.1 β-防御素的来源和分布12
• 1.3.2 β-防御素的分子结构特征12-13
• 1.3.3 β-防御素的生物学活性13
• 1.4 益生性酵母菌13-14
• 1.5 益生菌诱导防御素表达的研究进展14-15
• 1.6 NF-kB及MAPKs信号通路15-16
• 1.7 研究目的及意义16-18
• 1.8 技术路线18-19
• 2 试验内容19-26
• 2.1 材料与方法19
• 2.1.1 试验材料19
• 2.1.2 仪器与试剂19
• 2.2 试验方法19-25
• 2.2.1 绵羊RECs的培养和鉴定19-20
• 2.2.2 酿酒酵母菌的培养20-21
• 2.2.3 酿酒酵母菌诱导SBD-1表达及其信号通路初步研究21-22
• 2.2.4 绵羊RECs总RNA的提取22-23
• 2.2.5 总RNA的反转录23-24
• 2.2.6 RT-qPCR24-25
• 2.2.7 RT-qPCR标准曲线建立25
• 2.2.8 SBD-1 mRNA表达水平的计算25
• 2.2.9 统计分析25
• 2.3 ELISA检测共培养上清中SBD-1蛋白的表达及标准曲线的绘制25-26
• 3 结果26-36
• 3.1 细胞培养26
• 3.2 绵羊RECs的鉴定26-27
• 3.3 总RNA纯度及质量分析27-28
• 3.4 标准品的鉴定28
• 3.5 RT-qPCR结果28-30
• 3.5.1 SBD-1基因和β-actin基因RT-qPCR扩增曲线及熔解曲线28-30
• 3.5.2 SBD-1基因和β-actin基因PCR扩增效率曲线30
• 3.6 酿酒酵母菌对绵羊RECs SBD-1 mRNA相对表达量的影响30-31
• 3.7 酿酒酵母菌对绵羊RECs SBD-1 蛋白相对表达量的影响31-32
• 3.7.1 ELISA试验标准曲线31-32
• 3.7.2 酿酒酵母菌诱导RECs培养上清中SBD-1的蛋白表达检测结果32
• 3.8 酿酒酵母菌诱导SBD-1表达的信号通路初步研究结果32-36
• 4 讨论36-40
• 4.1 酿酒酵母菌诱导绵羊RECs SBD-1的表达36-37
• 4.2 酿酒酵母菌诱导绵羊RECs SBD-1表达的信号通路初步研究37-40
• 5 结论40-41
• 6 展望41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-51
• 作者简介51

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本文编号：579176