雏鸭感染DRV后炎性相关因子与脾损伤间的动态关系

发布时间：2017-07-27 08:26

  本文关键词：雏鸭感染DRV后炎性相关因子与脾损伤间的动态关系

  更多相关文章： 鸭呼肠孤病毒 炎症反应 多克隆抗体 脾损伤 双链RNA激活蛋白激酶

【摘要】：鸭呼肠孤病毒病是由鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)引起的以脾表面出现黄白色坏死灶,法氏囊萎缩为主要特征的一种急性传染病,该病毒可感染雏鸭和鸡,继发感染其他病原引起动物死亡,给养殖业带来较大的经济损失。目前关于哺乳动物脾损伤的机制研究已逐步深入,研究结果表明PKR在各种损伤过程中发挥着重要作用。但是关于鸭PKR介导的炎症反应还未见报道,且是否参与DRV引起脾损伤的进程还不清楚。因此研究PKR在脾损伤中的作用是很有必要的。本研究通过建立人工感染模型,探讨PKR介导的炎症信号通路在DRV感染雏鸭致脾损伤中的作用。主要包括以下几个方面:1.DuTNF-α多克隆抗体的制备本实验以雏鸭脾组织的RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增DuTNF-α基因,克隆至pET-28a载体上,经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定测序分析正确后,获得重组质粒pET-28a-DuTNF-α,转化至大肠杆菌Rosetta中,在IPTG终浓度1mmol/L和37℃条件下诱导4h,外源基因获得高效表达。通过Ni柱对蛋白进行纯化,纯化后的DuTNF-α蛋白免疫新西兰大耳白兔,经三次免疫后取全血,分离得到DuTNF-α多克隆抗体。利用Elisa和免疫组织化学染色检测结果表明多克隆抗体有较好的反应原性。2.建立DRV感染7日龄樱桃谷鸭模型分别在雏鸭感染后1d、3d、5d、7d、14d剖杀取脾组织。从组织形态学判定脾损伤程度,采用组织病理学及免疫组织化学判定炎症反应的产生。利用RT-qPCR技术检测感染后脾中PKR、MKK6、AP-1、IPS-1、NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表达量的动态变化,并分别取5个时间点实验组和对照组的脾脏石蜡切片,每组各取三个重复样品进行免疫组化,使用数字切片扫描仪将切片扫描,使用单位面积阳性率进行结果分析。眼观病变发现,感染后1d、3d脾显著肿大,颜色逐渐加深,部分病灶呈暗黑色,感染5d后脾颜色恢复正常,脾表明可见明显大小不一的黄白色病灶。组织病理学观察结果发现感染后3d脾出血严重,白髓淋巴细胞明显减少,感染后5d脾脏可见明显的坏死灶,坏死灶与周围健康细胞分界明显,感染7d后可见明显的肉芽肿结构。根据Opriessning T的评定标准对脾组织学病理损伤进行评定发现感染3d后出血严重,感染5d后发生坏死,感染7d后形成肉芽肿结构。用DRV特异性抗体及炎症细胞特异性抗体进行免疫组织化学染色,证明脾产生严重的炎症反应。荧光定量检测脾中PKR介导的炎症信号通路相关因子的表达量,结果显示PKR在感染后1d、3d、5d处于上调表达,且5d达到峰值,7d、14d与5d试验组相比差异显著(P0.05),这与病毒的表达量呈正相关,说明PKR可能参与dsRNA的识别,从而激活下游因子引起脾脏损伤。MKK6、AP-1、IPS-1在感染过程中均无上调表达,而NF-κB在整个感染过程中一直处于上调表达。可见在DRV感染雏鸭后PKR参与病毒的识别,并激活NF-κB入核启动转录相关因子。下游炎症因子TNF-α表达趋势与NF-κB一致,IL-6在感染3d后上调表达,到7d达到峰值,说明TNF-α与IL-6参与脾炎症反应。免疫组化统计结果说明在感染过程中TNF-α蛋白上调表达,第5d达到最高,这与荧光定量结果相符。结论:DRV感染雏鸭脾脏结构和功能均受到影响,脾脏PKR炎症信号通路被激活且激活状态与脾损伤的程度相关。炎症细胞因子TNF-α、IL-6在感染后显著升高,提示PKR炎症信号通路以及TNF-α、IL-6的表达参与DRV致脾损伤。
【关键词】：鸭呼肠孤病毒 炎症反应 多克隆抗体 脾损伤 双链RNA激活蛋白激酶
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.32
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 缩略语表(Abbreviation)12-13
• 前言13-20
• 1 鸭呼肠孤病毒的研究进展13-14
• 2 双链RNA激活蛋白激酶14-18
• 2.1 PKR概述14-16
• 2.1.1 PKR的抑制蛋白翻译的作用15
• 2.1.2 PKR诱导细胞凋亡15
• 2.1.3 PKR诱导炎症反应15-16
• 2.2 PKR介导的炎症信号通路16-18
• 2.2.1 PKR介导的MAPKs炎症反应16
• 2.2.2 PKR介导的NF-κB信号通路16-17
• 2.2.3 PKR介导的IPS-1 信号通路17-18
• 3 鸭肿瘤坏死因子 α 概述18-20
• 3.1 禽类炎性相关因子的概述18
• 3.2 鸭肿瘤坏死因子18-19
• 3.3 TNF-α 在脾炎症中的作用19-20
• 研究目的及意义20-21
• 材料与方法21-37
• 1 材料21-24
• 1.1 试验动物、毒株、抗体及表达相关材料21
• 1.2 主要仪器设备21-22
• 1.3 主要试剂22
• 1.4 主要试剂配制22-24
• 1.4.1 RNA提取相关试剂22
• 1.4.2 细菌培养、蛋白表达纯化相关试剂22-24
• 1.4.3 ELISA相关试剂24
• 1.4.4 透析袋的处理24
• 2 试验方法24-37
• 2.1 DuTNF-α 多克隆抗体的制备24-29
• 2.1.1 DuTNF-α 基因的PCR引物设计24
• 2.1.2 RT-PCR对目的基因的扩增24-25
• 2.1.3 PCR产物的回收25-26
• 2.1.4 重组原核表达质粒的构建26-27
• 2.1.5 重组质粒的提取与鉴定27-28
• 2.1.6 重组蛋白的表达与鉴定28-29
• 2.1.7 重组蛋白的纯化与复性29
• 2.1.8 免疫方案29
• 2.2 多克隆抗体DuTNF-α 的鉴定29-30
• 2.2.1 间接ELISA检测血清免疫原性29-30
• 2.2.2 DuTNF-α 在肝、脾免疫组织化学鉴定30
• 2.3 试验动物分组及处理30
• 2.4 试验样品的采集与保存30
• 2.5 感染JZ061214株DRV雏鸭的组织学病理变化动态观察30-31
• 2.6 鸭呼肠孤病毒及巨噬细胞在脾组织中的定位31-32
• 2.7 实时荧光定量RT-PCR检测雏鸭脾PKR介导的炎症信号通路相关因子及炎性因子mRNA的表达量32-35
• 2.7.1 组织总RNA的提取32
• 2.7.2 引物的设计32-33
• 2.7.3 RT- PCR扩增检测脾PKR、MKK6、AP-1 和IPS-1 基因33-34
• 2.7.4 实时荧光定量PCR扩增目的基因34-35
• 2.8 脾脏中TNF-α 的免疫组化定量分析35-36
• 2.9 数据分析36-37
• 试验结果37-54
• 1 DuTNF-α 多克隆抗体的制备37-41
• 1.1 DuTNF-α 的克隆37
• 1.2 重组原核表达质粒的构建37-38
• 1.3 DuTNF-α 基因序列分析38-39
• 1.4 重组表达质粒pET-28a-TNF-α 的酶切鉴定39
• 1.5 重组菌的诱导表达产物鉴定与纯化39-40
• 1.6 重组蛋白的Western-bolt鉴定40-41
• 2 多克隆抗体的制备与反应原性检测41-42
• 2.1 免疫兔血清抗体效价的测定41
• 2.2 免疫组化检测DuTNF-α 的反应原性41-42
• 3 雏鸭感染JZ061214株DRV的临床表现与眼观病变42-43
• 4 JZ061214株DRV感染雏鸭的组织学病理变化结果43-45
• 5 免疫组织化学技术检测脾病毒的组织分布45-46
• 6 免疫组织化学技术检测脾炎症反应46-47
• 7 实时荧光定量RT-PCR检测雏鸭脾PKR介导的炎症信号通路相关因子及炎性因子mRNA的表达量47-52
• 7.1 实时荧光定量检测目的基因结果47
• 7.2 RT-qPCR检测脾PKR、MKK6、AP-1、IPS-1、NF-κB、TNF-α、IL-6 的mRNA表达量结果47-52
• 8 TNF-α 在脾中的表达检测52-54
• 讨论54-58
• 1 DuTNF-α 克隆表达与多克隆抗体的制备54
• 2 JZ株061214株DRV感染雏鸭的临床症状和脾脏病理变化的动态观察54-55
• 3 炎症反应在DRV引起脾损伤中的作用55-58
• 3.1 DRV感染雏鸭后脾炎症反应检测55
• 3.2 PKR介导的炎症信号通路在脾损伤中的作用55-58
• 结论58-59
• 参考文献59-66
• 致谢66

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本文编号：580535