不同来源β-酪蛋白基因启动子调控人IFNα-2b基因的表达效率

发布时间：2017-07-28 14:13

  本文关键词：不同来源β-酪蛋白基因启动子调控人IFNα-2b基因的表达效率

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【摘要】：【目的】为获得高启动效率的乳腺特异启动子,对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β-酪蛋白基因启动子进行比较研究。【方法】对Genbank中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子序列进行比对分析,按照保守序列分别设计启动子区和3′端ploy A序列引物,同时设计人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列引物并引入预先设计的酶切位点以方便载体构建。采集静脉血液,提取基因组DNA。PCR克隆β-酪蛋白基因启动子区和3′端ploy A区,同时以实验室保存质粒为模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列。测序正确后,将各片段按设计顺序依次插入p MD18-T骨架中,构建成p HSTBCNp-IFN,p JSBCNp-IFN和p SNBCNp-IFN乳腺特异表达载体。将各载体转染Bcap-37细胞,经G418筛选出稳定整合的转基因细胞系。用胰岛素(1 mg·L-1),转铁蛋白因子(1 mg·L-1),氢化可的松(1 mg·L-1)和PRL(250IU·L-1)联合对转基因细胞系进行诱导,然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技术和ELISA方法分别在m RNA水平和蛋白质水平检测IFNα-2b的表达。【结果】PCR后获得了荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子区,长度分别为5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外显子,第一内含子和部分第二外显子,部分第二外显子的51个碱基编码17个氨基酸的信号肽序列。克隆了1 166 bp的ploy A区序列。最终将构建的3个乳腺特异表达载体转染Bcap-37细胞并经过G418筛选后,获得了3个转基因细胞系。经激素诱导后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA检测发现3个转基因细胞系都表达了IFNα-2b基因,并且发现娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控IFNα-2b基因的表达上效率较高,在m RNA水平和蛋白质水平上显著高于其他两个启动子(P0.05)。【结论】娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控外源基因表达上具有较高的效率,是具有应用前景的乳腺特异性启动子。所构建的表达载体为IFNα-2b转基因动物乳腺生物反应器的制备奠定基础。
【作者单位】： 广西大学动物科学技术学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室;江苏省农业科学院畜牧研究所/动物品种改良与繁育重点实验室;
【关键词】： 启动子 娟姗牛 干扰素α-b Bcap- 转基因
【基金】：国家“863”项目(2011AA100607) 国家转基因专项(2014ZX08007001-002)
【分类号】：S823
【正文快照】： 0前言【研究意义】转基因动物乳腺生物反应器中的乳腺特异表达启动子一般由乳蛋白启动子来承担。为使外源蛋白高效表达,在乳腺特异表达载体的设计中,启动子的选择至关重要。【前人研究进展】乳蛋白启动子的特异性由启动子区中激素调节等相关元件来决定[1]。其中主要的特异性相

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