猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌DNAH和LAMP检测方法的建立

发布时间：2017-07-30 00:01

  本文关键词：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌DNAH和LAMP检测方法的建立

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【摘要】：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)、沙门氏菌(Salmonella,Sal)三种病原菌均能引起猪的重大传染性疾病,分别是猪呼吸道疾病综合征常见的原发性病原和继发性病原,引发的相关疾病具有高发病率和死亡率,给世界各地的养猪业造成严重的经济损失。早期诊断对疾病的防治非常关键,目前,针对上述三种细菌的检测方法主要以传统检测方法为主,兼有PCR方法、基因芯片方法等,但都存在一定的不足,如检测周期长、敏感性较低等,无法满足大批量样品快速准确检测。因此,迫切需要建立高通量、简便快速、特异强、敏感性高、稳定性好的检测方法。本研究分别运用夹心DNA杂交技术(Sandwich DNA hybridization assay,DNAH)和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification assays,LAMP),针对上述三种病原菌,各自建立了DNAH和LAMP两种快速检测方法,为APP、HPS、Sal病原菌的疫病早期诊断与治疗、疫情监控、流行病学调查等提供有效的技术保障,以减少传染病对养猪业的危害,促进养猪业健康稳定的发展。同时,作为一种新型的检测技术储备研究更具有重要的前瞻意义。本研究的试验方法和结果如下:1、参照Gen Bank中登录的不同血清型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的Apx IVA基因序列,副猪嗜血杆菌的16S r RNA基因序列以及沙门氏菌的inv A基因序列,通过MEGA5.0软件对序列进行比对与分析,利用primer 5软件进行夹心DNA杂交技术一条捕获探针和一条检测探针的设计,利用在线生物软件Primer Explorer V4进行环介导等温扩增技术6条引物的设计。将设计的三种病原菌各自的探针和引物在NCBI上进行Blast比对,特异性均较高。2、通过对三种病原菌进行探针浓度、核酸杂交液探针液配比以及杂交时间和杂交温度的优化,分别建立了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌的夹心DNA杂交检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性和稳定性试验。结果显示:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的夹心DNA杂交检测方法仅与目标病原菌有特异性的杂交反应,与其它相关病原菌均无特异性杂交;该方法的最低检测限为0.46 CFU/m L;不同样品重复测定的OD450值变异系数CVi在8.30%~10.29%之间,不同样品用不同批次的96孔板所测的OD450值变异系数CVo在16.78%~20.07%之间,具有良好的精确度。副猪嗜血杆菌的夹心DNA杂交检测方法具有良好的特异性,仅与目标病原菌发生特异性杂交,而与其它相关病原菌均无杂交反应,该方法的最低检测限为0.31 CFU/m L,批内变异系数CVi在10.97%~16.22%之间,批间变异系数CVo在18.32%~22.50%之间。沙门氏菌的夹心DNA杂交检测方法仅与三种不同血清型的沙门氏菌发生特异性的杂交反应,而与其它相关病原菌均无特异性杂交反应,该方法的最低检出限为1.2 CFU/m L,批内变异系数CVi在16.53%~17.97%之间,批间变异系数CVo在16.33%~22.10%之间。3、通过对三种病原菌进行反应温度、内引物浓度以及环引物浓度的优化,分别建立了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌的环介导等温扩增方法,并进行了相应的特异性、敏感性、重复性和稳定性试验。结果显示:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的环介导等温扩增方法只对该细菌的DNA有特异性扩增,对其它相关病原均无特异性的扩增,最低检测限为0.307 fg/μL,具有良好的批内重复性和批间稳定性,变异系数CV分别为0.67%和2.21%;副猪嗜血杆菌的环介导等温扩增方法只对其目标菌DNA有特异性扩增,对其余病原菌无特异性扩增,最低检测限为0.175 fg/μL,批内重复性试验和批间稳定性试验的变异系数CV分别为0.76%和3.84%;沙门氏菌的环介导等温扩增方法只对三种不同血清型的沙门氏菌DNA有特异性扩增,对其余病原体均无特异性扩增反应,检测敏感性为0.810 fg/μL,批内重复性试验和批间稳定性试验的变异系数CV分别为1.47%和2.45%。4、用本研究建立的两种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌快速检测方法与SN/T 1447-2011标准中猪传染性胸膜肺炎套式PCR检测方法,同时对204份临床疑似猪传染性胸膜肺炎发病猪的肺脏样品进行对比分析,结果显示:三种方法对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检出率均为4.9%,符合率为100%,本研究建立的两种方法与标准公布的套式PCR方法相比,其检测时间大幅缩短。用本研究建立的两种副猪嗜血杆菌快速检测方法与NY/T 2417-2013标准公布的方法,同时对195份临床疑似感染副猪嗜血杆菌的病猪鼻拭子进行检测,结果显示:本研究建立的两种方法检测出的副猪嗜血杆菌阳性率均为4.62%,标准公布的PCR方法检出阳性率为3.08%,其阳性样品的检出低于本研究建立的两种方法,且检测时间也明显较长。用本研究建立的两种沙门氏菌快速检测方法与SN/T 1869-2007标准公布的沙门氏菌检测方法,同时对371份临床疑似感染沙门氏菌病猪肉样品进行检测分析,结果显示:本研究建立的两种方法检出沙门氏菌的阳性率均为6.2%,标准公布的沙门氏菌PCR方法检出阳性率为5.7%,表明DNAH和LAMP检测方法对沙门氏菌的阳性检出率比PCR方法高,且耗时比PCR方法短。综上所述,本研究分别针对三种常见猪传染性疾病相关病原菌建立的两种快速检测方法,均有较高的特异性、敏感性和稳定性,并在较短时间内(DNAH和LAMP方法分别在1.5 h和1 h内完成检测)实现对单个病原菌感染的样品进行快速准确的鉴别。
【关键词】：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 副猪嗜血杆菌 沙门氏菌 DNAH LAMP
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 第1章 综述12-22
• 1.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的研究现状12-14
• 1.1.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的生物学特征12
• 1.1.2 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型分类12
• 1.1.3 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子12-13
• 1.1.4 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的流行病学研究13
• 1.1.5 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的检测方法研究进展13-14
• 1.2 副猪嗜血杆菌的研究现状14-15
• 1.2.1 副猪嗜血杆菌的生物学特征14
• 1.2.2 副猪嗜血杆菌的血清学分类14
• 1.2.3 副猪嗜血杆菌的毒力因子14
• 1.2.4 副猪嗜血杆菌的流行病学研究14-15
• 1.2.5 副猪嗜血杆菌的检测方法研究进展15
• 1.3 沙门氏菌的研究现状15-17
• 1.3.1 沙门氏菌的生物学特征15-16
• 1.3.2 沙门氏菌的血清学分类16
• 1.3.3 沙门氏菌的毒力因子16
• 1.3.4 沙门氏菌的流行病学研究16
• 1.3.5 沙门氏菌的检测方法研究进展16-17
• 1.4 夹心DNA杂交技术(DNAH)17-18
• 1.4.1 DNAH技术概述17
• 1.4.2 DNAH技术反应原理17-18
• 1.4.3 DNAH技术特点18
• 1.4.4 DNAH技术发展前景18
• 1.5 环介导等温扩增技术(LAMP)18-22
• 1.5.1 LAMP技术概述18-19
• 1.5.2 LAMP技术反应原理19
• 1.5.3 LAMP技术特点19-20
• 1.5.4 LAMP技术发展前景20-22
• 第2章 引言22-26
• 2.1 研究目的及意义22
• 2.2 研究内容22-23
• 2.2.1 基因序列分析及探针和引物的分析22
• 2.2.2 分别建立三种病原菌的DNAH检测方法22-23
• 2.2.3 分别建立三种病原菌的LAMP检测方法23
• 2.2.4 方法间的比较23
• 2.3 技术路线23-26
• 2.3.1 分别建立三种病原菌DNAH检测方法的技术路线，见图 2-1。23-24
• 2.3.2 分别建立三种病原菌LAMP检测方法的技术路线，见图 2-2。24-26
• 第3章 三种病原菌DNAH检测方法的优化及建立26-48
• 3.1 材料、主要试剂及仪器26-28
• 3.1.1 标准菌株26
• 3.1.2 主要试剂26-27
• 3.1.3 主要仪器27
• 3.1.4 主要试剂配制27-28
• 3.2 方法28-32
• 3.2.1 细菌的增殖28
• 3.2.2 序列分析及探针设计28-29
• 3.2.3 DNAH技术操作步骤29-30
• 3.2.4 DNAH检测条件的优化30
• 3.2.5 DNAH特异性试验30-31
• 3.2.6 DNAH敏感性试验与对比试验31-32
• 3.2.7 DNAH重复性和稳定性试验32
• 3.3 结果32-46
• 3.3.1 探针设计32-34
• 3.3.2 DNAH检测条件的优化及建立34-37
• 3.3.3 DNAH特异性试验37-39
• 3.3.4 DNAH敏感性试验与对比试验39-43
• 3.3.5 DNAH重复性试验和稳定性试验43-46
• 3.4 讨论46-48
• 3.4.1 目的基因的选择46
• 3.4.2 探针的设计及筛选46
• 3.4.3 三种病原菌DNAH检测方法的评价46-47
• 3.4.4 DNAH检测方法的应用评价47-48
• 第4章 三种病原菌LAMP检测方法的优化及建立48-78
• 4.1 材料、主要试剂及仪器48-51
• 4.1.1 标准菌株、毒株48-49
• 4.1.2 主要试剂49-50
• 4.1.3 主要仪器50
• 4.1.4 主要试剂配制50-51
• 4.2 方法51-54
• 4.2.1 细菌的增殖51
• 4.2.2 核酸的提取51-52
• 4.2.3 序列分析及引物设计52
• 4.2.4 LAMP检测条件的优化52-53
• 4.2.5 LAMP特异性试验53
• 4.2.6 LAMP敏感性试验与对比试验53-54
• 4.2.7 LAMP重复性和稳定性试验54
• 4.3 结果54-73
• 4.3.1 引物设计54-56
• 4.3.2 引物的验证56-58
• 4.3.3 LAMP检测条件的优化及建立58-64
• 4.3.4 LAMP特异性试验64-66
• 4.3.5 LAMP敏感性试验与对比试验66-71
• 4.3.6 LAMP重复性试验和稳定性试验71-73
• 4.4 临床应用73-75
• 4.4.1 APP检测方法的临床应用73
• 4.4.2 APP临床检测结果与分析73-74
• 4.4.3 HPS检测方法的临床应用74
• 4.4.4 HPS临床检测结果与分析74
• 4.4.5 Sal检测方法的临床应用74
• 4.4.6 Sal检测结果与分析74-75
• 4.5 讨论75-78
• 4.5.1 LAMP引物的设计及筛选75
• 4.5.2 三种病原菌LAMP检测方法的评价75-76
• 4.5.3 LAMP技术的改进与发展76
• 4.5.4 两种快速检测方法的临床应用评价76-78
• 第5章 结论78-80
• 参考文献80-88
• 附录 188-90
• 声明90-92
• 致谢92-94
• 攻读硕士期间论文发表及专利、项目参与情况94

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