猪食欲肽受体2激动剂细胞筛选模型的建立及其应用

发布时间：2017-07-31 13:35

  本文关键词：猪食欲肽受体2激动剂细胞筛选模型的建立及其应用

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【摘要】：食欲肽(Orexin)是由下丘脑食欲肽能神经元分泌的一类神经肽,它能够在大脑不同区域高效地表达,可对动物的能量平衡进行有效的调节。食欲肽是通过对应的受体即食欲肽受体(OX1R和OX2R)发挥其功能的,它与动物的多种生理功能相关,但是最主要是在摄食与能量平衡上起到的重要作用。cAMP/PKA信号通路是OXR的经典信号通路,当其配体(激动剂或拮抗剂)与OXR结合后,改变细胞内cAMP的水平,进而引起蛋白激酶A (PKA)状态的变化,引发相应的生理学效应。目前,虽然关于OX2R信号通路方面的研究已有报道,但在家畜方面的报道仍比较少,特别是猪,而猪的体重又是重要经济指标。同时,有研究表明OX2R是一种非选择性的受体,可与其匹配的激动剂范围更宽泛一些。但关于以OX2R为靶点的细胞筛选模型的建立与应用方面的研究却尚未见报道。本研究在猪OX2R真核表达质粒成功构建的基础上,以cAMP水平变化所建立的报告基因检测方法为依据,建立以猪OX2R为靶点的稳定、可靠的猪OX2R激动剂细胞筛选模型,对选取的部分中药的提取物进行筛选,用来发现一些其他非内源性的激动剂,为筛选提高猪的生产效率的先导化合物及相关药物的研发做一些基础性的研究。主要研究结果如下：1、将猪OX2R真核表达质粒pcDNA3.1 (+)-myc/pOX2R与荧光素酶报告基因质粒PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]以1：5的比例共转染到CHO-K1细胞,通过G418 (800μg/ml)和潮霉素B (400μg/ml)进行抗性筛选并利用有限稀释法得到萤火虫荧光素酶的相对表达量最高的一株单克隆株作为阳性细胞株；提取其总RNA,RT-PCR后在预期位置扩增出猪OX2R基因(1332bp)的目的条带,同时,通过力Foskolin检测萤火虫荧光素酶表达量的变化,证实了萤火虫荧光素酶基因的成功转入。2、将pcDNA3.1(+)空载体和PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]荧光素酶报告基因质粒以1：5的比例按上述方法共转染CHO-K1细胞株,按1方法得到荧光素酶表达量最高且背景值较低的单克隆株作为阴性细胞株。同时,通过转染后加IFoskolin检测萤火虫荧光素酶表达量的变化,证实了萤火虫荧光素酶基因的成功转入。阴性细胞株用于内源性受体及假阳性激动剂的排除。3、对所选阳性单克隆细胞筛选模型进行条件优化,发现当激动剂OXB终浓度为10-6mol/L,孵育时间为9h,溶剂DMSO终浓度小于等于3%及检测试剂Luciferase AssayReagent用量为原液的1/2时,筛选模型Z因子值为0.85,说明建立的筛选方法可靠、稳定,可用于OX2R激动剂的筛选。4、分别利用醇提法与水提法对18种天然中药进行有效成分提取,得到36种天然提取物样品,利用建立的猪OX2R稳定细胞株进行激动剂的筛选并利用阴性细胞株排除了假阳性天然提取物样品,得到本底比大于2的提取物样品共3种,其中醇提物2种,水提物1种;利用HEK293T细胞进行瞬时转染对得到的3种阳性提取物样品进行剂量效应关系的研究,发现在一定浓度范围内,3种提取物样品均具有良好的剂量效应关系。
【关键词】：猪食欲肽受体2 细胞筛选模型 中药 提取物
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 符号说明10-11
• 第一章 文献综述11-30
• 1 食欲肽与其受体11-18
• 1.1 食欲肽与其受体的结构特征和分类11-12
• 1.2 食欲肽B(OXB)及其受体的生理功能12-13
• 1.3 食欲肽及其受体的研究现状13-16
• 1.4 食欲肽受体2参与的信号转导机制16-18
• 2 高通量药物筛选18-24
• 2.1 高通量药物筛选的研究进展18-20
• 2.2 基于细胞模型的高通量药物筛选20-22
• 2.3 靶向G蛋白偶联受体的高通量药物筛选方法22-24
• 3 天然中药材提取液的制备24-28
• 3.1 天然中药材有效成分的提取24-26
• 3.2 天然中药材有效成分的提取工艺研究进展26-27
• 3.3 影响天然中药材提取效果的因素27-28
• 4 本研究的目的与意义28-30
• 第二章 以猪食欲肽受体2为靶点的细胞筛选模型的建立30-50
• 1 材料30-31
• 1.1 主要仪器设备30
• 1.2 主要试剂30-31
• 1.3 主要溶液的配制31
• 2 试验方法31-38
• 2.1 CHO-K1细胞的复苏、传代培养与铺板31-32
• 2.2 稳定细胞株的建立32-34
• 2.3 验证阳性细胞、阴性细胞中目的基因的表达34-35
• 2.4 优化筛选条件35-36
• 2.5 筛选方法评估36-37
• 2.6 pOX2R细胞株内源性干扰的检测37
• 2.7 荧光素酶报告基因检测37
• 2.8 数据处理与分析37-38
• 3 结果与分析38-46
• 3.1 阳性及阴性细胞株的筛选和确定38-40
• 3.2 验证目的基因及萤火虫荧光素酶基因的转入40-42
• 3.3 筛选条件的优化结果42-45
• 3.4 筛选方法的评估结果45
• 3.5 猪OX2R阳性细胞株内源性干扰的检测结果45-46
• 4 讨论46-49
• 4.1 报告基因的确定46-47
• 4.2 基于pOX2RcAMP/PKA信号通路的细胞筛选模型建立的理论依据47-48
• 4.3 稳定细胞模型的优化与评估原则48-49
• 5 本章小结49-50
• 第三章 猪食欲肽受体2激动剂的细胞筛选模型的应用50-64
• 1 材料50-51
• 1.1 主要仪器设备50
• 1.2 主要试剂50-51
• 2 试验方法51-54
• 2.1 天然中药材提取物的制备51-52
• 2.2 pOX2R受体激动剂的筛选52-53
• 2.3 瞬时转染法分析阳性提取物的剂量效应关系53-54
• 2.4 数据处理与分析54
• 3 结果与分析54-61
• 3.1 选取的天然中药材的名称与提取物浓度54-55
• 3.2 pOX2R受体激动剂的筛选结果55-57
• 3.3 阳性提取物的剂量效应关系分析57-61
• 4 讨论61-63
• 4.1 天然中药材的选择61
• 4.2 天然中药材提取方法的确定61-62
• 4.3 阳性化合物剂量效应关系的探索及其有效成分、作用机理的探讨62-63
• 5 本章小结63-64
• 全文结论64-65
• 参考文献65-72
• 致谢72-73
• 在读期间发表的文章73-74

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本文编号：599435