抗菌肽Caerin1.1抑制猪流行性腹泻病毒增殖的研究

发布时间：2017-08-02 05:07

  本文关键词：抗菌肽Caerin1.1抑制猪流行性腹泻病毒增殖的研究

  更多相关文章： 抗菌肽Caerin1.1 猪流行性腹泻病毒 抗病毒活性 抑制机制

【摘要】：猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染可造成各年龄段猪群发生腹泻、消瘦,感染仔猪死亡率可达80%~100%,急需有效药物用于特异性防控,但目前该病以免疫预防为主,没有合适且高效的药物。抗菌肽(Antimicrobial peptide,AMP)是动植物在天然免疫中产生的小分子多肽,有广谱抗微生物活性。已有文献报道抗菌肽对囊膜病毒的感染、增殖有较好的抑制作用,但未见其具体对猪流行性腹泻病毒的作用研究。本研究探索了本实验室合成的五种抗菌肽对PEDV的体外抑制效果,筛选出抗病毒活性较高的抗菌肽Caerin1.1,研究了其抗病毒活性和机制,主要结果如下:1.确定不同抗菌肽的抗病毒活性和细胞毒性分别用5种抗菌肽(Caerin1.1,Piscidin1,Maculatin1.1,Lactoferricin B,Indolicidin等)与PEDV孵育,测定TCID50。结果显示Caerin1.1与Piscidin1抑制效果显著,且Caerin1.1优于Piscidin1。在抗菌肽浓度低于110μg/m L的条件下,二者细胞毒性都很小,细胞相对活力均可达到80%以上,显微镜下观察细胞形态良好,因此后续研究中所用的抗菌肽浓度均处于安全范围内。2.Caerin1.1孵育条件及抑制效果探索分别设置孵育温度和孵育时间梯度,孵育后倍比稀释并接种Vero细胞,测定病毒TCID50,结果发现,最佳孵育条件为37℃孵育1h。Caerin1.1和Piscidin1对PEDV的抑制效果显著,但两者没有协同作用。Caerin1.1对3个不同PEDV毒株的抑制效果均十分显著且呈剂量依赖,PEDV-YN株病毒滴度可从10-4.5下降至10-1.5。3.抗菌肽Caerin1.1直接杀伤病毒,发挥其抗病毒作用设置抗菌肽与病毒作用的3个不同方式,即Caerin1.1与细胞提前孵育1h后接种PEDV;Caerin1.1与PEDV孵育1h后接种于细胞;细胞先接种PEDV 1h后加入Caerin1.1。测定TCID50,绘制生长曲线,结果表明Caerin1.1与病毒提前孵育时病毒滴度下降最多,其他两种处理方式时,PEDV滴度仅有一定程度下降,说明Caerin1.1发挥作用的主要阶段在与病毒直接孵育的过程。通过透射电子显微镜观察发现,抗菌肽和病毒孵育后破坏病毒囊膜完整性,Western blot试验发现,抗菌肽和病毒直接孵育后感染细胞,PEDV-N蛋白表达量显著下降,说明病毒感染细胞的能力下降,增殖被抑制。4.吸附入侵及释放阶段抑制效果探索通过增加4℃孵育时间,分别延长PEDV吸附和入侵细胞时间,随后加入Caerin1.1,孵育3h后弃去含抗菌肽的培养基,结果显示即使Caerin1.1浓度增加,病毒的滴度与病毒对照相比仍无显著差异,说明Caerin1.1对PEDV入侵和吸附宿主细胞的过程无抑制效果。病毒侵入细胞后(接毒1h后)加入抗菌肽,分别测定上清病毒和胞内病毒滴度,结果显示抗菌肽处理组的胞内病毒滴度与病毒对照组胞内病毒滴度无显著差异,说明病毒在细胞内的复制和组装并未受到抑制;而上清中PEDV的滴度有显著下降,且毒价上升趋势延缓,说明Caerin1.1可抑制病毒释放。对Caerin1.1进行FITC标记,细胞内定位结果显示Caerin1.1定位在细胞质;在无PEDV感染的对照组细胞中,Caerin1.1呈随机散在分布状态,而在PEDV感染的细胞中,Caerin1.1则呈聚集状态,与病毒的分布状况高度一致。综上所述,我们筛选出能有效抑制PEDV增殖的抗菌肽Caerin1.1和Piscidin1。发现Caerin1.1主要破坏病毒囊膜抑制病毒增殖,但也抑制病毒从细胞内释放。研究结果为防控PED提供了新的生物制剂。
【关键词】：抗菌肽Caerin1.1 猪流行性腹泻病毒 抗病毒活性 抑制机制
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 缩略语表(Abbreviation)11-12
• 第1章 文献综述12-23
• 1.1 猪流行性腹泻疾病概述12-17
• 1.1.1 病原学特点12-14
• 1.1.2 流行病学特征14
• 1.1.3 临床症状及病理变化14-15
• 1.1.4 诊断及防治15-17
• 1.1.5 抗PEDV的药物17
• 1.2 抗菌肽研究进展17-23
• 1.2.1 简介及分类17-19
• 1.2.2 抗菌活性及作用机制19
• 1.2.3 抗病毒和抗肿瘤活性的研究进展19-21
• 1.2.4 应用现状及潜力21-22
• 1.2.5 抗菌肽Caerin的研究概况22-23
• 第2章 目的与意义23-24
• 第3章 材料与方法24-34
• 3.1 材料24-26
• 3.1.1 毒株、细胞及抗菌肽24
• 3.1.2 主要仪器与耗材24-25
• 3.1.3 主要试剂25
• 3.1.4 主要溶液的配制25-26
• 3.2 方法26-34
• 3.2.1 抗菌肽初步筛选26
• 3.2.2 细胞毒性检测26-27
• 3.2.3 抗菌肽联合作用27
• 3.2.4 Caerin1.1 时效观察27-28
• 3.2.5 Caerin1.1 抗病毒活性的剂量依赖28
• 3.2.6 Caerin1.1 作用条件28-29
• 3.2.7 Caerin1.1 对PEDV的抑制效果29
• 3.2.8 Caerin1.1 抗病毒作用机制29-31
• 3.2.9 Caerin1.1 对PEDV的直接杀伤效果31
• 3.2.10 Caerin1.1 对病毒吸附入侵阶段的影响31-32
• 3.2.11 Caerin1.1 对病毒组装释放阶段的影响32-33
• 3.2.12 Caerin1.1 的细胞内定位33-34
• 第4章 结果与分析34-46
• 4.1 抗菌肽对PEDV的抑制效果34-40
• 4.1.1 各抗菌肽对PEDV-YN株的抑制效果34
• 4.1.2 细胞毒性分析34-35
• 4.1.3 联合作用抗病毒效果35-37
• 4.1.4 温度对Caerin1.1 时效的影响37
• 4.1.5 Caerin1.1 抗病毒活性的剂量依赖37-38
• 4.1.6 Caerin1.1 与PEDV的最适孵育条件38-39
• 4.1.7 Caerin1.1 对PEDV其它毒株的抑制效果39-40
• 4.2 Caerin1.1 对PEDV的抑制机制40-46
• 4.2.1 不同时间点的抑制效果40-42
• 4.2.2 对PEDV的直接杀伤效果验证42
• 4.2.3 对PEDV吸附入侵阶段的影响42-44
• 4.2.4 对PEDV增殖释放阶段的影响44-45
• 4.2.5 在Vero细胞内的定位45-46
• 第5章 讨论与结论46-50
• 5.1 讨论46-49
• 5.1.1 不同抗菌肽对PEDV抑制效果差异分析46-47
• 5.1.2 Caerin1.1 抑制PEDV的机制47-48
• 5.1.3 抗菌肽的优缺点及应用前景48-49
• 5.2.结论49-50
• 参考文献50-60
• 附录60-62
• 致谢62

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 吴润;邢丽丽;郝葆青;宋慧;;抗菌肽的研究进展[J];西南民族大学学报(自然科学版);2005年S1期

2 张召兄;潘晓亮;任耀军;;抗菌肽概述及抗菌分子机理的研究进展[J];草食家畜;2006年04期

3 李明魁;郭菊;张遂平;;抗菌肽的研究与应用[J];现代畜牧兽医;2007年01期

4 张兰廷;刘忠渊;张富春;;抗菌肽结构与功能关系及分子改造研究进展[J];生物技术;2008年05期

5 廖世奇;周思彤;曾家豫;;生物抗菌肽的研究进展[J];甘肃医药;2009年01期

6 谭显胜;李巍巍;王志明;袁哲明;;抗菌肽的研究进展[J];现代生物医学进展;2009年16期

7 李书伟;晏家友;;抗菌肽的研究进展[J];四川畜牧兽医;2010年05期

8 朱鑫;马清泉;董娜;单安山;;改良型抗菌肽的研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2012年09期

9 蔡灵;;抗菌肽来源及其应用进展[J];安徽农业科学;2013年13期

10 梁世德,张士璀;抗菌肽和抗菌肽基因[J];海洋科学;1994年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 徐家萍;王成林;杨莹;尤征英;;多功能抗菌肽及其分子改造的研究进展[A];华东·华中地区第十二次蚕种学术研讨会论文集[C];2010年

2 孙振钧;;蚯蚓抗菌肽研究进展[A];畜牧业环境、生态、安全生产与管理——2010年家畜环境与生态学术研讨会论文集[C];2010年

3 尚德静;白冰;李晓帆;付欣;郑俊杰;;中国林蛙(Rana chensinensis)皮肤抗菌肽基因和功能多样性研究[A];“基因、进化与生理功能多样性”海内外学术研讨会暨中国生理学会第七届比较生理学学术会议论文摘要[C];2009年

4 黄自然;黄亚东;温刘发;郑青;廖富频;胡建雄;黄国庆;姜丽华;黄永彤;李运南;梁淑娃;彭中建;董加喜;夏枫耿;陈松彬;;抗菌肽生物工程及其应用[A];全国桑树种质资源及育种和蚕桑综合利用学术研讨会论文集[C];2005年

5 廖富，

本文编号：607718