小鼠绿脓杆菌和仙台病毒LAMP检测方法的建立及其初步应用

发布时间：2017-08-02 09:10

  本文关键词：小鼠绿脓杆菌和仙台病毒LAMP检测方法的建立及其初步应用

  更多相关文章： 环介导等温扩增 小鼠 绿脓杆菌 仙台病毒

【摘要】：实验动物是生命科学研究中最基本的四大支撑要素之一,动物实验科学研究的重复性和准确性要有实验动物的质量作保障。在现代医学研究和生命科学研究中,小鼠是最常用的实验动物,其微生物质量将直接影响实验结果的准确性。根据GB14922.2-2011规定,小鼠绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是无特定病原体(specific pathogen free animal,SPF)实验小鼠的必须检测的项目之一;仙台病毒(Sendai virus,SeV)是清洁级实验小鼠的必须检测的项目之一。目前,已经报道的检测小鼠绿脓杆菌和仙台病毒的方法有:分离培养、RT-PCR、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunoabsorbent Assay,ELISA)等。传统的分离培养方法准确性高,但该方法操作繁琐、费力、耗时,且检出率低,易出现假阴性。RT-PCR和ELISA检测方法灵敏度高,但该方法对仪器要求较高,易出现假阳性。本研究应用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),分别根据小鼠绿脓杆菌和仙台病毒基因组的高度保守序列,采用PrimerExpler V4软件设计LAMP的6条特异性引物,通过优化其反应体系条件,分别建立了小鼠绿脓杆菌LAMP检测方法和小鼠仙台病毒lamp检测方法,并对其方法的特异性、稳定性、重复性、灵敏度依次进行验证,且初步应用于临床检测。本研究主要有两部分组成。第一部分小鼠绿脓杆菌lamp检测方法的建立及其初步应用目的建立一种实验小鼠绿脓杆菌(pa)的环介导等温扩增(lamp)检测方法。方法采用环介导等温扩增(lamp)技术,以小鼠pa的oprl基因的序列为靶基因,采用primerexploerv4软件设计了两套lamp引物,其中每套引物包含6条特异性序列,应用dna提取试剂盒提取padna,通过优化lamp反应体系条件建立小鼠pa特异性的lamp检测方法(pa/lamp)。同时,对该方法的特异性、稳定性、重复性、灵敏度进行验证,并初步应用于临床检测。结果所建立的pa/lamp方法可特异性的检测出pa/dna,对其它常见病原体均为阴性;pa/lamp能检测出不同批次同一时间或同一批次不同时间的pa/dna;pa/lamp检测pa/dna的最低检测含量为0.29pg,与pcr检测方法相比较,其灵敏度高约105倍;临床检测,pa的阳性率为27.7%(10/36);全部反应可在1h内完成;通过添加荧光染料sybrgreeni可直观目测实验结果。结论建立的pa/lamp方法,具有特异、准确、灵敏、快速、简便的特点,可用于实验小鼠pa的快速检测。第二部分小鼠仙台病毒lamp检测方法的目的建立一种实验小鼠仙台病毒(sev)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。方法采用环介导等温扩增(LAMP)技术,以小鼠SeV(gi:9627219)F蛋白的基因序列为目标基因,采用PrimerExploer V4软件设计LAMP的6条特异性引物,应用病毒RNA提取试剂盒提取SeV RNA,通过优化LAMP反应体系条件,建立小鼠SeV的LAMP检测方法(SeV/LAMP)。同时,对该方法的特异性、稳定性、重复性、灵敏度进行验证,并初步应用于临床检测。结果所建立的SeV/LAMP方法可检测出SeV RNA,对其它常见病原体均判为阴性;SeV/LAMP能检测出不同批次同一时间或同一批次不同时间的SeV RNA;SeV/LAMP检测SeV RNA的最低检测含量为0.33 pg,与ELISA检测方法相比较,其检出率高(分别为5/30和2/30);临床检测,SeV的阳性率为27.5%(11/40);全部反应可在1 h内完成;通过添加荧光染料SYBR Green I可直观目测实验结果。结论建立的LAMP方法,具有特异、准确、灵敏、快速、简便的特点,可用于实验小鼠SeV的快速检测。
【关键词】：环介导等温扩增 小鼠 绿脓杆菌 仙台病毒
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.91
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分 小鼠绿脓杆菌LAMP检测方法的建立及其初步应用15-36
• 1 材料16
• 2 方法16-21
• 3 结果21-32
• 4 讨论32-34
• 参考文献34-36
• 第二部分 小鼠仙台病毒LAMP检测方法的建立及其初步应用36-49
• 1 材料36-37
• 2 方法37-39
• 3 结果39-45
• 4 讨论45-47
• 参考文献47-49
• 全文总结49-50
• 文献综述50-60
• 参考文献57-60
• 致谢60-61
• 发表的论文、参与的科研项目及学术会议61

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本文编号：608507