一株可裂解大肠杆菌和沙门氏菌的噬菌体基因组学分析及其裂解酶活性鉴定

发布时间：2017-08-03 19:26

  本文关键词：一株可裂解大肠杆菌和沙门氏菌的噬菌体基因组学分析及其裂解酶活性鉴定

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【摘要】：大肠杆菌和沙门氏菌是两种重要的人畜共患病的病原,在世界范围内已经造成了重大的经济损失并严重威胁着公共卫生安全。随着抗生素的大量和不合理使用,这两种细菌的多重耐药菌株层出不穷,使得新型有效抗菌制剂的开发迫在眉睫。由于噬菌体及其裂解酶与细菌长期共同进化,且具有高效杀菌活性,因此这两者作为新的抗生素替代物或者是对抗生素的一种补充得到科学界的重视。本研究旨在分离鉴定针对大肠杆菌和沙门氏菌的多价噬菌体,并获取其裂解酶,试图开发针对这两种致病菌的新型抗菌制剂。本研究以一株临床分离的猪源大肠杆菌为宿主菌,从污水中分离纯化到一株烈性噬菌体,命名为ECGD1。用磷钨酸负染法观察其形态,并进一步测定其最佳感染复数及宿主谱。对ECGD1进行全基因序列测定,利用生物信息学软件进行基因预测和功能注释,并通过全基因组序列比对分析ECGD1与相关噬菌体的进化关系。通过基因组学分析,预测ECGD1裂解酶基因,利用基因工程手段进行体外表达,并进一步鉴定表达产物的裂解活性及与多粘菌素B的协同抑菌效果。结果显示:(1)大肠杆菌噬菌体ECGD1可形成透明、边缘清晰的噬菌斑;电镜下观察到ECGD1具有典型的二十面体头部和伸缩性的尾部,尾部附有一簇尾丝,属于有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科;最佳感染复数为10-3;通过宿主谱测定,发现ECGD1是一株宽裂解谱噬菌体,可裂解临床分离的6株大肠杆菌(6/12)和17株沙门氏菌(17/26),同时还可裂解大肠杆菌基因工程菌株DH5α和BL21。(2)通过基因组测序及分析,发现ECGD1基因组全长146 647 bp,平均GC含量为37.5%,包含11个tRNA和2个pseudo-tRNA基因;共预测出234个CDS,78个被赋予假定的功能,另外156个功能未知。已赋予功能的CDS,可分为核苷酸代谢/DNA复制/重组、基因组包装、结构蛋白基因、裂解基因和其它功能基因等五大类;全基因组比对发现,ECGD1与大肠杆菌噬菌体phi92同源性很高,属于rv-5 like属的成员。(3)本试验成功构建了表达裂解酶的重组质粒pET-32a-lysin,在BL21(DE3)中成功表达出了裂解酶重组蛋白,经SDS-PAGE分析该表达产物主要为可溶性蛋白,且表达量较高;经过活性鉴定,发现该重组蛋白具有菌内及菌外裂解活性;且该重组蛋白与多粘菌素B的联用降低了多粘菌素B的最低抑菌浓度。综上所述,本研究分离的ECGD1是肌尾噬菌体科rv-5 like属的成员,是一株宽裂解谱的噬菌体,且经体外表达的裂解酶初步鉴定具有杀菌效果,因此,噬菌体ECGD1及其裂解酶在大肠杆菌和沙门氏菌感染的防控上具有潜在的应用价值。
【关键词】：大肠杆菌 沙门氏菌 噬菌体 基因组学 裂解酶
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文缩略词7-11
• 1 前言11-16
• 1.1 大肠杆菌简介11
• 1.2 沙门氏菌简介11-12
• 1.3 噬菌体及噬菌体治疗12-13
• 1.4 噬菌体裂解酶及裂解酶治疗13-15
• 1.5 本研究目的与意义15-16
• 2 材料与方法16-29
• 2.1 试验材料16-18
• 2.1.1 菌种与质粒16
• 2.1.2 主要试剂与药品16-17
• 2.1.3 主要仪器设备17-18
• 2.2 噬菌体的分离、鉴定及部分生物学特性分析18-19
• 2.2.1 噬菌体的分离纯化18
• 2.2.2 噬菌体形态的电镜观察18
• 2.2.3 噬菌体悬液效价的测定18-19
• 2.2.4 噬菌体ECGD1的最佳感染复数的测定19
• 2.2.5 噬菌体宿主范围的测定19
• 2.3 噬菌体ECGD1的基因组学分析19-22
• 2.3.1 噬菌体扩繁浓缩及基因组的提取19-20
• 2.3.2 噬菌体全基因组测序20
• 2.3.3 噬菌体功能基因组学分析20-21
• 2.3.4 裂解酶基因编码蛋白的结构预测21-22
• 2.4 噬菌体ECGD1裂解酶lysin的表达及活性鉴定22-29
• 2.4.1 裂解酶基因lysin的引物设计和基因扩增22
• 2.4.2 裂解酶基因PCR产物回收22-23
• 2.4.3 裂解酶基因PCR产物与pET-32a的双酶切23
• 2.4.4 裂解酶基因PCR产物与pET-32a的双酶切产物的连接23-24
• 2.4.5 重组质粒pET-32a-lysin的制备24-25
• 2.4.6 重组质粒pET-32a-lysin转化BL21（DE3）感受态细胞25
• 2.4.7 目的蛋白的诱导表达25
• 2.4.8 表达产物的SDS-PAGE分析25-26
• 2.4.9 目的蛋白的纯化及浓度测定26-27
• 2.4.10 表达产物裂解活性的检测27-28
• 2.4.10.1 菌内裂解活性的检测27
• 2.4.10.2 菌外裂解活性的检测27-28
• 2.4.11 表达产物裂解谱的测定28
• 2.4.12 多粘菌素B与重组蛋白联用裂解活菌28-29
• 3 结果与分析29-57
• 3.1 噬菌体分离、鉴定及部分生物学特性29-32
• 3.1.1 噬菌体分离29
• 3.1.2 噬菌体ECGD1的形态29-30
• 3.1.3 噬菌体ECGD1效价测定30-31
• 3.1.4 噬菌体ECGD1的最佳感染复数（MOI）31
• 3.1.5 噬菌体ECGD1的宿主范围31-32
• 3.2 噬菌体ECGD1全基因组序列测定及分析32-48
• 3.2.1 噬菌体基因组一般特性分析32
• 3.2.2 噬菌体基因组tRNA分析32-33
• 3.2.3 噬菌体基因组基因预测与功能注释33-44
• 3.2.3.1 核苷酸代谢/DNA复制/重组相关基因34-43
• 3.2.3.2 基因组包装相关基因43
• 3.2.3.3 结构蛋白基因43
• 3.2.3.4 裂解基因43
• 3.2.3.5 其它功能基因43
• 3.2.3.6 有害基因筛查结果43-44
• 3.2.4 噬菌体基因组比较分析44-45
• 3.2.5 裂解酶基因编码蛋白的结构预测结果45-48
• 3.2.5.1 结构域预测45
• 3.2.5.2 跨膜区域预测45-46
• 3.2.5.3 信号肽预测46-47
• 3.2.5.4 二级结构预测结果47
• 3.2.5.5 三级结构预测结果47-48
• 3.3 噬菌体ECGD1裂解酶lysin的表达及活性鉴定48-57
• 3.3.1 裂解酶基因lysin的PCR扩增及重组质粒的鉴定48-49
• 3.3.2 裂解酶lysin诱导表达的SDS-PAGE分析49-51
• 3.3.3 裂解酶lysin纯化51
• 3.3.4 裂解酶lysin裂解活性鉴定51-54
• 3.3.4.1 裂解酶lysin菌内裂解活性检测51-52
• 3.3.4.2 裂解酶lysin菌外裂解活性检测52-54
• 3.3.5 裂解酶lysin裂解谱测定54-56
• 3.3.6 裂解酶lysin与多粘菌素B协同作用效果56-57
• 4 讨论57-63
• 4.1 噬菌体生物学特性的探讨57-58
• 4.2 噬菌体基因组学探讨58-60
• 4.3 裂解酶表达的探讨60-61
• 4.4 裂解酶活性鉴定的探讨61-62
• 4.5 裂解酶与多粘菌素B协同作用的探讨62-63
• 5 结论63-64
• 致谢64-65
• 参考文献65-70
• 硕士期间所获奖励与发表文章70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 任慧婧;谭艾娟;吕世明;刘芸;刘玉梅;张家俊;胡美忠;;市售鸡肉中沙门氏菌的污染及耐药性研究[J];黑龙江畜牧兽医;2016年03期

2 江萍;夏利宁;苏战强;林亚军;;规模化养殖场猪粪源沙门氏菌的耐药性调查[J];中国农学通报;2015年35期

3 王崔岩;郭月玲;彭亮;仲伟潭;;多粘菌素B研究进展[J];煤炭与化工;2014年08期

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本文编号：615965