FSH及WNT信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞功能的影响

发布时间：2017-08-08 11:06

  本文关键词：FSH及WNT信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞功能的影响

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【摘要】：Wnt信号通路普遍存在于哺乳动物体内,至今已发现3条主要的Wnt信号通路,可调控多种发生过程。研究发现Wnt信号通路在神经系统发育,组织、器官发育以及肿瘤的发生过程中都存在重要作用,此外,Wnt信号通路与卵泡的发育也存在密切的联系。而IWR-1是Wnt/β-catenin经典信号通路的一种抑制剂,它可以改变多蛋白复合体的稳定性,最终起到抑制该经典信号通路的作用。虽然对Wnt的研究已经很广泛,但目前关于Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞功能的影响以及该影响与FSH之间的相互作用还未见报道。为了进一步了解Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞的调节机制,本研究选择了通路中多个起主要作用的基因,检测其在绵羊不同大小卵泡中的表达差异,初步了解Wnt信号通路在卵泡发育过程中的表达情况。随后进行颗粒细胞的体外培养,培养体系分为8种不同浓度：0 ng·mL~(-1) FSH、0 μmol·L~(-1) IWR-1; 0 ng·mL~(-1) FSH、0.1 μmol·L~(-1) IWR-1; 0ng·mL~(-1) FSH、1μmol·L~(-1) IWR-1; 0ng·mL~(-1) FSH、10μmol·L~(-1) IWR-1; 5 ng·mL~(-1) FSH、 0 μmol·L~(-1) IWR-1; 5 ng·mL~(-1) FSH、0.1μmol·L~(-1) IWR-1; 5 ng·mL~(-1) FSH.1 μmol·L~(-1) IWR-1; 5 ng·mL~(-1) FSH、10μmol·L~(-1) IWR-1.每个浓度6个重复,隔48 h换一次液,培养168 h后收集所培养的颗粒细胞及培养液。利用Guava ViaCount(?) Reagent测定细胞数目的变化,利用绵羊ELISA试剂盒检测雌激素的浓度,通过qRT-PCR检测FSH靶基因CYP19和CCND2的相对表达量差异。试验结果如下：1.CTNNB1在大卵泡中表述相对较多(P0.05),FZD6在大、中卵泡中表达拼相对较多(P0.05),DVL1在不同大小卵泡中的表达量无明显差异,AXIN2在中、小卵泡中表达量相对较多(P0.05)。综上所述,随着绵羊卵泡的增大,Wnt信号通路在卵泡中的表达也基本呈现出递增趋势,因此Wnt信号通路可能促进绵羊卵泡的发育。2.当未添加最适浓度的FSH时,0.1 μmol·L~(-1)和1 μmol·L~(-1)的IWR-1使颗粒细胞数目显著减少(P0.05)；当培养基中存在最适浓度的FSH时,不同浓度IWR-1的作用均使颗粒细胞数目减少且更加显著。对于雌激素浓度,只有当FSH存在时,抑制剂IWR-1的添加才能导致雌激素浓度显著降低(P0.05)。因此,当IWR-1的浓度为1 μmol·L~(-1)时,对颗粒细胞的抑制效果最明显,且这种作用与FSH的存在有关。3.Wnt信号通路抑制剂IWR-1使绵羊卵泡颗粒细胞中FSH的靶基因CYP19 mRNA和CCND2 mRNA的相对表达量降低。本研究结果支持Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞的生物学功能具有促进作用,并且这种促进作用与FSH有关。
【关键词】：绵羊 卵泡 颗粒细胞 Wnt信号通路 IWR-1 FSH
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要7-9
• 第一章 文献综述9-21
• 1 哺乳动物卵泡的发生9-14
• 1.1 哺乳动物原始卵泡库的形成和发育9
• 1.2 卵泡发育9-11
• 1.3 卵泡发育的调控机制11
• 1.4 发情周期卵泡的调节机制11-14
• 2 颗粒细胞及其在卵泡发育中的功能14-15
• 2.1 颗粒细胞14
• 2.2 颗粒细胞对卵泡发育的影响14-15
• 3 卵泡颗粒细胞体外培养15-16
• 3.1 颗粒细胞体外培养的重要性15
• 3.2 颗粒细胞体外培养体系15-16
• 3.3 外源FSH对体外培养的颗粒细胞的影响16
• 4 Wnt信号通路研究进展16-20
• 4.1 Wnt的发现及其信号通路16-17
• 4.2 经典Wnt/β-catenin信号通路17-18
• 4.3 Wnt信号通路功能的研究18-20
• 5 本研究的目的和意义20-21
• 第二章 WNT信号通路关键基因在绵羊大、中、小卵泡颗粒细胞中的表达21-30
• 1 材料与方法21-26
• 1.1 试验材料21-22
• 1.2 主要试验仪器及试剂22-23
• 1.3 试验方法23-26
• 2 结果与分析26-28
• 2.1 PCR扩增电泳结果26-27
• 2.2 CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2、β-Actin的扩增曲线和熔解曲线27
• 2.3 CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2在不同大小卵泡中的表达差异27-28
• 3 讨论28-29
• 4 小结29-30
• 第三章 WNT信号通路的阻断对绵羊卵泡颗粒细胞功能的影响30-42
• 1 试验材料与方法30-34
• 1.1 试验动物30
• 1.2 主要试验试剂及仪器30-33
• 1.3 试验方法33-34
• 2 试验结果与分析34-40
• 2.1 添加不同浓度FSH和IWR-1的培养体系中颗粒细胞的生长状况34-36
• 2.2 不同浓度FSH和IWR-1的处理下对颗粒细胞增殖的影响36-37
• 2.3 不同浓度FSH和IWR-1的处理对颗粒细胞雌激素分泌的影响37
• 2.4 IWR-1抑制Wnt信号通路作用的证明37-38
• 2.5 不同浓度FSH和IWR-1的处理下FSH靶基因的表达差异38-40
• 3 讨论40-41
• 4 小结41-42
• 全文结论42-43
• 参考文献43-47
• 特色与创新47-49
• 在读期间发表论文49-51
• Abstract51-53
• 附录53-55
• 致谢55

【参考文献】

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本文编号：639640