一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂研究

发布时间：2017-08-08 14:03

  本文关键词：一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂研究

  更多相关文章： 禽流感 H5N1 灭活苗 表位 杆状病毒 辅助制剂

【摘要】：H5N1高致病性禽流感病毒(H5N1 highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)严重危害禽类养殖业以及人类健康。疫苗接种是防控禽流感的有效策略,当前使用的全病毒灭活苗主要通过血凝素蛋白(HA)诱导特异性中和抗体的产生,而HA变异频繁,造成疫苗对异源毒株的保护力不足。过去几年,中国政府陆续推出了一系列来自H5 HA不同进化分支的灭活疫苗来控制H5N1禽流感病毒,但始终不能跟上病毒变异的节奏。因此,亟需一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂,弥补禽流感灭活疫苗对异源毒株保护力不足的缺陷。研究已证实流感病毒多个保守B、T淋巴细胞表位的结合能够同时刺激体液和细胞免疫反应。研究表明H5N1 AIV血凝素茎区(HA2)76-130位氨基酸高度保守,人工合成的HA2 76-130多肽免疫小鼠后能够对多个亚型流感病毒的攻击提供保护。A型流感病毒基质蛋白M2胞外区(M2e),同样也是高度保守的抗原,已经被广泛用于通用疫苗的研究。此外,核蛋白(nucleoprotein,NP)第55-69和380-393位氨基酸能够分别刺激辅助型T细胞、细胞毒性T细胞,对流感病毒的交叉保护具有重要作用。尽管表位疫苗能够引起广泛的免疫反应,单独依靠抗原表位难以抵抗H5N1 HPAIV的攻击,基于以上原因,将表位抗原作为一种辅助制剂,与H5N1灭活苗联合使用,也许是一种可行的策略。本研究选取了H5N1 AIV 4个高度保守的抗原表位包括HA2 76-130、3M2e、NP55-69以及NP380-393(HMNN)。含柔性连接序列(linker)的基因片段HMNN由公司合成,克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac-VSV-G多角体蛋白启动子下游获得p Fast-G-HMNN。按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统操作手册获得重组杆状病毒BV-HMNN。为了评价重组杆状病毒与灭活苗联合使用对异源H5N1病毒的保护效力,本研究以SPF鸡作为动物模型,肌肉注射免疫0.1 mL(1010 pfu/mL)BV-HMNN和0.3 mL对应2.3.2.1分支的Re-6灭活苗(Re-6+BV-HMNN),同时设杆状病毒野毒与Re-6灭活苗联合免疫组(Re-6+BV-WT)、Re-6灭活苗单独免疫组(Re-6)以及PBS对照组(Mock)。单次免疫后3周,用2.3.4.4分支的禽流感病毒A/goose/guangdong/14079/2013(GD/14079,H5N1)进行攻毒保护试验。实验结果表明,当与Re-6灭活苗联合免疫时,BV-HMNN不会影响灭活苗的HI效价却能显著增加M2e特异性IgG抗体滴度。在应对致死剂量的异源GD/14079病毒攻击时,Re-6+BV-HMNN免疫组保护率为100%,而Re-6免疫组仅获得了50%的保护。在排毒检测方面,Re-6+BV-HMNN组在攻毒后3、5、7天都没有从口咽和泄殖腔拭子中分离到病毒,而Re-6组在攻毒后第5天检测到1只鸡排毒,攻毒后第7天检测到3只鸡排毒。PBS对照组在攻毒后第3天检测到排毒,第5天达排毒高峰,第7天全部死亡。Re-6+BV-WT免疫组的保护效果也优于Re-6单独免疫组,主要表现为鸡的存活率更高、拭子的病毒滴度更低。综上所述,将重组杆状病毒BV-HMNN作为一种辅助制剂,与H5N1灭活苗联合使用,能够增强灭活苗的异源保护力,在应对H5N1禽流感病毒的变异以及流感大流行方面具有重要意义。
【关键词】：禽流感 H5N1 灭活苗 表位 杆状病毒 辅助制剂
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.79
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文缩略词8-12
• 1 前言12-23
• 1.1 流感病毒12-14
• 1.1.1 H5N1高致病性禽流感流行现状12-13
• 1.1.2 禽流感病毒分子生物学13-14
• 1.2 禽流感疫苗的研究进展14-19
• 1.2.1 全病毒灭活疫苗14-15
• 1.2.2 DNA疫苗15
• 1.2.3 重组活载体疫苗15-16
• 1.2.4 基因工程亚单位疫苗16
• 1.2.5 通用型流感疫苗16-19
• 1.3 昆虫杆状病毒表达系统19-22
• 1.3.1 昆虫杆状病毒表达系统概述19-21
• 1.3.2 昆虫杆状病毒表达系统在禽流感疫苗研究中的应用21-22
• 1.4 研究目的和意义22-23
• 2 材料与方法23-37
• 2.1 材料23-26
• 2.1.1 病毒23
• 2.1.2 细胞23
• 2.1.3 菌种与质粒23
• 2.1.4 抗体23
• 2.1.5 主要试剂23-24
• 2.1.6 细胞培养试剂配制24
• 2.1.7 细菌培养试剂配制24
• 2.1.8 抗生素配制24-25
• 2.1.9 质粒提取相关试剂25
• 2.1.10 其它试剂配制25-26
• 2.1.11 主要仪器和设备26
• 2.2 方法26-37
• 2.2.1 重组质粒pc DNA3.1-HMNN的构建与鉴定26-29
• 2.2.2 重组质粒p Fast-G-CMV-HMNN的构建与鉴定29-31
• 2.2.3 三抗高盐LB琼脂培养平板的制备31
• 2.2.4 重组杆状病毒BV-HMNN的获得31-33
• 2.2.5 重组杆状病毒BV-HMNN的鉴定33-34
• 2.2.6 重组杆状病毒的纯化与毒价测定34
• 2.2.7 免疫原性分析以及攻毒保护实验34-37
• 3 结果与分析37-45
• 3.1 抗原表位氨基酸序列37
• 3.2 重组质粒pc DNA3.1-HMNN的鉴定37-38
• 3.3 重组转移质粒p Fast-G-CMV-HMNN的鉴定38-39
• 3.4 重组穿梭载体Bacmid-G-HMNN的鉴定39-40
• 3.5 重组杆状病毒BV-HMNN的获得40
• 3.6 重组杆状病毒结构示意图40
• 3.7 重组杆状病毒BV-HMNN转导CEF细胞40-41
• 3.8 HI抗体和M2e抗体检测41-42
• 3.9 保护率42-43
• 3.10 排毒情况43-45
• 4 讨论与结论45-48
• 全文总结48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-56
• 附录A pc DNA3.1 (+) 表达载体图谱56-57
• 附录B p Fast Bac~(TM) Dual表达载体图谱57-58
• 附录C 硕士期间发表文章58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：640326