牛GHR基因与miR-139靶向关系的验证

发布时间：2017-08-10 08:02

  本文关键词：牛GHR基因与miR-139靶向关系的验证

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【摘要】：旨在构建牛生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)基因3′非翻译区(Untranslated region,UTR)双荧光素酶载体,并确定miR-139与牛GHR基因的靶向关系。本研究采用生物信息学方法预测miR-139与牛GHR基因3′UTR的结合位点;人工合成牛GHR基因3′UTR及突变型片段并克隆至双荧光素酶载体psiCHECK-2上,构建野生型(psiCHECK2-GHR-W 3′UTR)及突变型(psiCHECK2-GHR-M 3′UTR)双荧光素酶报告质粒。将培养的Hela细胞分为4组,分别共转染miR-139mimic或阴性对照和psiCHECK2-GHR-W 3′UTR重组质粒或psiCHECK2-GHR-M 3′UTR重组质粒,然后用双荧光素酶检测试剂盒检测4组细胞中荧光素酶活性。之后培养奶牛乳腺上皮细胞,分别设对照组、阴性对照组、miR-139 mimic及miR-139inhibitor组,对阴性对照组、miR-139mimic组及miR-139inhibitor组分别转染阴性对照、miR-139mimic或miR-139inhibitor,利用qPCR(Realtime quantitative PCR)进一步检测各组miR-139及GHR基因的mRNA表达。结果,通过双酶切试验证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和psiCHECK2-GHR-M 3′UTR;当野生型重组质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和miR-139mimic共转染Hela细胞后,双荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其他处理组(P0.05)。qPCR进一步证实miR-139能显著下调奶牛乳腺上皮细胞中GHR基因mRNA的表达(P0.05)。本研究成功构建了牛野生型及突变型GHR基因3′UTR双荧光素酶报告质粒;双荧光素酶试验及qPCR证实miR-139与牛GHR基因3′UTR存在靶向关系。
【作者单位】： 东北农业大学生命科学学院;
【关键词】： 牛 生长激素受体 ′非翻译区 miR-
【基金】：国家自然基金青年基金(31401093) 留学回国人员科研启动基金 黑龙江省教育厅科研项目(12541018)
【分类号】：S823
【正文快照】： microRNAs(miRNAs)是约22个核苷酸、进化上保守、内源性非编码的RNA,以序列特异性的方式结合至靶mRNA的3′-非翻译区(3′UTR),可在转录后通过抑制转录或下调mRNA表达来调节基因表达[1-2]。研究发现每个miRNA可调节约200个mRNA,每个mRNA有多重潜在靶基因位点与miRNA结合[3-4]。

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