猪雄性生殖干细胞体外长期培养体系的建立

发布时间：2017-08-11 20:33

  本文关键词：猪雄性生殖干细胞体外长期培养体系的建立

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【摘要】：雄性生殖干细胞是位于曲精细管内的特殊的成体干细胞类群,具有自我更新维持群体数量动态平衡以及分化进入精子发生的能力,在干细胞生物学、再生医学、转基因动物制作及男性不育治疗等领域具有重要的科学意义和应用价值。雄性生殖干细胞数量极为稀少,且占睾丸总细胞比率极低,严重限制了相关研究进展。因而纯化及体外扩增雄性生殖干细胞,将有望为后续研究提供源源不断的研究材料。本研究旨在利用细胞培养和分子生物学方法优化猪雄性生殖干细胞富集方案,并探究血清替代物、生长因子组合等在其体外培养的影响,优化猪雄性生殖干细胞体外培养条件,成功建立体外长期培养体系,为猪雄性生殖干细胞后续研究奠定基础。本研究主要研究结果如下:1、优化差异贴壁方案对猪雄性生殖干细胞进行富集。分别对富集前后细胞进行PLZF、GFRA1和UCHL1免疫细胞荧光染色,结果显示富集后生殖干细胞纯度由富集前的10.50±0.13%提高至72.66±2.96%,显著优于传统差异贴壁方案28.71±1.00%。2、探究血清替代物(Konckout serum replacement,KSR)对猪雄性生殖干细胞体外增殖的作用。结果表明,在血清浓度1%条件下添加血清替代物KSR(10%),与对照组相比可以显著提高pMGSCs体外增殖能力。3、探究不同生长因子组合对猪雄性生殖干细胞体外扩增的影响,结果显示GDNF、bFGF、IgF1均能不同程度促进生殖干细胞克隆形成与扩张。其中GDNF(10ng/mL)、GFRA1(20ng/mL)和bFGF(10ng/mL)联合添加效果最佳。4、在本试验筛选的条件下,完成猪雄性生殖干细胞体外培养2月,传代10次;细胞免疫荧光、RT-PCR和western-blot证实培养后细胞仍表达雄性生殖干细胞分子标记UCHL1、PLZF、GFRA1等;核型分析显示染色体条数正常;将培养近2月猪雄性生殖干细胞移植到白消安处理的小鼠曲精细管,四周后仍可观察到红色荧光标记的猪雄性生殖干细胞定植于小鼠曲精细管基底膜并形成克隆。以上表明本试验成功建立了猪雄性生殖干细胞体外长期培养体系。该培养体系的建立将为猪雄性生殖干细胞增殖与分化机理的研究奠定基础,并为其他大家畜雄性生殖干细胞的研究提供参考依据。
【关键词】：猪 雄性生殖干细胞 分离与纯化 体外培养
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文献综述11-20
• 1.1 雄性生殖干细胞简介11
• 1.2 雄性生殖干细胞特性及其微环境11-14
• 1.3 雄性生殖干细胞的分离、富集与分子标记14-18
• 1.3.1 雄性生殖干细胞的分离14
• 1.3.2 雄性生殖干细胞的富集14-15
• 1.3.3 雄性生殖干细胞的分子标记15-16
• 1.3.4 雄性生殖干细胞的培养及其关键信号通路16-18
• 1.4 雄性生殖干细胞的移植18-20
• 1.4.1 雄性生殖干细胞移植技术18
• 1.4.2 精原干细胞移植受体的制备18-20
• 第二章 猪雄性生殖干细胞的分离纯化20-24
• 2.1 材料和方法20-21
• 2.1.1 材料20
• 2.1.2 主要试剂20
• 2.1.3 方法20-21
• 2.2 结果21-22
• 2.3 讨论22-23
• 2.4 小结23-24
• 第三章 不同添加物对猪雄性生殖干细胞体外培养的影响24-29
• 3.1 材料和方法24-25
• 3.1.1 材料24
• 3.1.2 主要试剂24
• 3.1.3 方法24-25
• 3.2 结果25-27
• 3.2.1 血清替代物在猪雄性生殖干细胞体外培养的影响25-26
• 3.2.2 不同浓度生长因子对猪雄性生殖干细胞增殖的影响26-27
• 3.3 讨论27-28
• 3.4 小结28-29
• 第四章 猪雄性生殖干细胞培养后鉴定29-35
• 4.1 材料和方法29-31
• 4.1.1 材料29
• 4.1.2 主要试剂29
• 4.1.3 方法29-31
• 4.2 结果31-34
• 4.2.1 猪雄性生殖干细胞克隆免疫细胞荧光染色31-32
• 4.2.2 猪雄性生殖干细胞RT-PCR、western-blot检验及核型分析32-33
• 4.2.3 猪雄性生殖干细胞的异种移植33-34
• 4.3 讨论34
• 4.4 小结34-35
• 第五章 结论及创新点35-36
• 参考文献36-41
• 附录41-43
• 致谢43-44
• 作者简介44

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1 记者 郑颖t牎∥飧，

本文编号：658144