猪流行性腹泻病毒E和M蛋白的表达及鉴定

发布时间：2017-08-12 07:07

  本文关键词：猪流行性腹泻病毒E和M蛋白的表达及鉴定

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【摘要】：猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性的、高度传染性的肠道疾病,5日龄内的仔猪感染后死亡率可达100%,给养猪业带来极大危害。接种疫苗是预防和控制PED的有效方法,但还没有特别有效的疫苗控制PED发生,因此研制新型、有效的PED疫苗是目前急需解决的问题。PEDV是由囊膜包裹的单条正链RNA病毒,基因组大小约为28kb。PEDV的膜糖蛋白(M)能够诱导机体产生针对PEDV的中和抗体,并且共表达M蛋白和E蛋白可与原病毒一样诱导机体产生干扰素,增强抗病毒的能力。因此,M蛋白和E蛋白成为PEDV基因工程疫苗的主要抗原。本研究先将PEDV E、M基因分别克隆至原核表达载体p ET-32a,重组载体转入BL21细胞后,经IPTG诱导表达E、M蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,制备E、M多克隆抗体。再将PEDV E和M基因克隆至p Fast Bac Dual载体,利用昆虫杆状病毒表达系统表达E和M蛋白,用制备的多克隆抗体对其进行检测,结果显示这两个蛋白与制备的E、M多克隆抗体有良好的反应性。本实验成功制备PEDV多抗,并且利用昆虫杆状病毒表达系统成功的表达出PEDV E和M蛋白,为PEDV的检测及PEDV疫苗的进一步研究奠定基础。
【关键词】：PEDV E基因 M基因 杆状病毒表达系统 多克隆抗体
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-10
• 英文缩写词注释10-11
• 引言11-12
• 第一篇 文献综述12-19
• 1 猪流行性腹泻简介12-17
• 1.1 猪流行性腹泻病毒的生物学研究12-15
• 1.1.1 PEDV的分子特征12-15
• 1.2 猪流行性腹泻的诊断15
• 1.3 猪流行性腹泻病毒的疫苗研究15-17
• 1.3.1 灭活疫苗16
• 1.3.2 细胞弱毒苗16
• 1.3.3 转基因植物疫苗16-17
• 1.3.4 核酸疫苗17
• 2 昆虫杆状病毒表达系统17-19
• 2.1 杆状病毒17-18
• 2.2 杆状病毒表达系统的优点18-19
• 2.2.1 基因容量大18
• 2.2.2 外源蛋白的表达量高且具有生物活性18
• 2.2.3 生物安全性高18-19
• 第二篇 研究内容19-53
• 第1章 猪流行性腹泻病毒E、M基因的原核表达及多克隆抗体的制备19-38
• 1.1 实验材料与试剂19-21
• 1.1.1 实验材料19
• 1.1.2 实验动物19-20
• 1.1.3 仪器设备20
• 1.1.4 主要实验试剂20-21
• 1.2 实验方法21-28
• 1.2.1 猪腹泻三联疫苗总RNA的提取21
• 1.2.2 PEDV E、M基因引物的设计和合成21-22
• 1.2.3 PEDV E、M目的基因的获取22-23
• 1.2.4 重组表达载体p ET-32a-E、p ET-32a-M的构建与鉴定23-24
• 1.2.5 PEDV E、M蛋白的表达及鉴定24-26
• 1.2.6 PEDV E、M蛋白的纯化26-27
• 1.2.7 小鼠抗E、M蛋白多克隆抗体的制备及特异性鉴定27-28
• 1.3 结果28-37
• 1.3.1 猪腹泻三联疫苗总RNA的提取28
• 1.3.2 PEDV E、M目的基因的获取28-29
• 1.3.3 重组表达载体p ET32a-E、p ET32a-M的构建与鉴定29-32
• 1.3.4 PEDV E、M蛋白的鉴定32-34
• 1.3.5 纯化后重组蛋白的SDS-PAGE分析34-36
• 1.3.6 多抗的鉴定36-37
• 1.4 讨论37
• 1.5 小结37-38
• 第2章 猪流行性腹泻病毒样E、M蛋白的真核表达及鉴定38-53
• 2.1 实验材料与试剂38-39
• 2.1.1 实验材料38
• 2.1.2 仪器设备38-39
• 2.1.4 实验试剂39
• 2.2 实验方法39-46
• 2.2.1 PEDV E、M基因引物的设计和合成39-40
• 2.2.2 PEDV E、M目的基因的获取40
• 2.2.3 转移载体p Fast Bac Dual-E-M的构建40-41
• 2.2.4 转移载体p Fast Bac Dual-E-M的初步鉴定及测序41-42
• 2.2.5 重组Bacmid的构建、提取42-44
• 2.2.6 重组Bacmid转染Sf9昆虫细胞44
• 2.2.7 重组杆状病毒的分离与扩增44-45
• 2.2.8 重组蛋白在昆虫细胞Sf9中的表达及鉴定45-46
• 2.3 结果46-51
• 2.3.1 PEDV E、M目的基因的合成46-47
• 2.3.2 转移载体p Fast Bac Dual-E-M的鉴定47-48
• 2.3.3 重组Bacmid DNA的鉴定48-49
• 2.3.4 重组杆状病毒的制备49-50
• 2.3.5 重组蛋白的检测50-51
• 2.4 讨论51-52
• 2.5 小结52-53
• 结论53-54
• 参考文献54-60
• 导师及作者简介60-61
• 致谢61

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1 古洪浪;邓胜朝;崔进;刘晓露;刘超;袁航;马岚;张桂红;;猪流行性腹泻病毒PEDV-GD12株的分离与鉴定[J];中国兽医杂志;2013年11期

2 杜晓莉;王一成;吴润;徐丽华;袁秀芳;李军星;周晓丽;;2010—2013年浙江省猪流行性腹泻病毒临床检测及PEDV-S基因型分析[J];浙江农业学报;2014年03期

3 邓祖丽颖;陈陆;;猪流行性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用[J];中国畜牧兽医;2014年01期

4 李宝贤;马广鹏;葛俊伟;李一经;;猪流行性腹泻病毒功能性受体的鉴定[J];病毒学报;2009年03期

5 ;Cloning the Structure Genes and Expression the N Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus DX[J];Virologica Sinica;2009年03期

6 田克恭;;兔胸水渗出病[J];上海实验动物科学;1993年02期

7 乔宪凤,熊忠良,华文君,郑新民;PEDV膜蛋白基因RT-PCR最适反应条件的确立[J];湖北畜牧兽医;2001年01期

8 高慎阳;王s，

本文编号：660309