深度测序法筛选和鉴定维持奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的关键因子

发布时间：2017-08-12 16:07

  本文关键词：深度测序法筛选和鉴定维持奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的关键因子

  更多相关文章： 转录组 精原干细胞 Pax7 自我更新 奶山羊

【摘要】：精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs),也称为雄性生殖干细胞,是位于睾丸组织曲细精管基基底膜上的一种成体干细胞,雄性生殖干细胞通过自我复制维持自身群体数量的稳定,又可发育分化成可遗传的配子-精子。SSCs是研究精子发生、减数分裂的分子调控和细胞重编程的一个理想的体外模型。雄性生殖干细胞作为精子发生过程中的起源性细胞,其本身具有维持自我更新和分化的双重性能,该种干细胞中存在复杂而又精密的调控机制。SSCs中存在的这一复杂而又庞大的调控网络必然也伴随着大量的调控因子,包括coding-RNA水平的基因,转录因子以及nocoding-RNA水平的miRNA,siRNA和lncRNA。为宏观整体地了解SSCs中可能存在的维持干性的调控因子,常规的试验验证方法已经不能够达到验证目的,随着DNA测序技术的飞速发展,第二代测序技术能够一次性完成DNA分子序列测定通量高达几十万到几百万条。使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。本研究将基于奶山羊这一物种对维持雄性生殖干细胞的自我更新相关因子进行筛选、鉴定及其作用机理的分析研究。已有报道Pax7可以作为小鼠睾丸中少量细胞群所表达的特异、全新的细胞标记,被相继应用到人类、灵长类等其他物种上。本实验通过Hiseq2000高通量测序平台对了奶山羊CD49f阴、阳性睾丸细胞的转录组表达谱进行测序,分析两类细胞中精原干细胞标记基因的表达特征。之后试验鉴定分选出的CD49f阳性睾丸细胞是奶山羊的精原干细胞群;并进一步从个体、细胞和分子水平研究了候选基因Pax7对奶山羊雄性生殖干细胞自我更新功能和细胞增殖的影响。1.奶山羊精原细胞的转录组表达谱利用免疫磁珠分选法和Hiseq2000深度测序分析技术获得了CD49f阴、阳性睾丸细胞的转录组表达谱,CD49f阴、阳性精原细胞中共同表达的有28880条基因,确定了574个在CD49f阳性睾丸细胞中表达上调2倍的基因和1426个在CD49f阴性睾丸细胞中上调2倍的基因。GO分析可得,1026(54%)个差异基因富集归类到“精子发生”(GO:0007283),有58个基因属于该GO项目下。分组分析表达量上下调的差异基因,发现在pathway通路分析中,CD49f阴性组表达量较高的基因能够富集到“Oocyte meiosis”(PATH:04114)通路上。2.Pax7基因在奶山羊睾丸中的功能作用利用QRT-PCR技术检测Pax7基因在奶山羊睾丸组织中表达规律,发现随年龄的增长,Pax7基因在逐渐减少。免疫荧光切片染色发现,Pax7基因特异的表达在曲细精管基底膜上的精原干细胞,但只有少量可着色,因此可将Pax7作为奶山羊早期精原干细胞的标记。利用NCBI数据库,通过电子克隆的方法获得奶山羊的Pax7全长序列并构建过表达载体pPax7-mCherry-N1。在mGSCs中过表达Pax7,结合QRT-PCR、免疫荧光染色等实验技术检测mGSCs中与自我更新与分化相关基因的变化情况,发现过表达Pax7组的细胞能较好的维持自我更新相关的基因PLZF、GFRa1、ID4、OCT4的表达,Pax7基因在奶山羊精原干细胞中过量表达在转录和蛋白水平促进PLZF,ID4,OCT4等多能性和自我更新相关基因的表达,可在一定水平上促进自我更新能力的维持。
【关键词】：转录组 精原干细胞 Pax7 自我更新 奶山羊
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 文献综述12-21
• 第一章 雄性生殖干细胞自我更新功能的研究进展12-21
• 1.1 雄性生殖干细胞12-17
• 1.1.1 雄性生殖干细胞的来源12-14
• 1.1.2 雄性生殖干细胞相关标记14-16
• 1.1.3 雄性生殖干细胞相关通路研究16
• 1.1.4 基于高通量测序的雄性生殖干细胞转录调控研究16-17
• 1.2 Pax7研究进展17-20
• 1.2.1 Pax7结构特征18
• 1.2.2 Pax7的功能研究18-20
• 1.3 存在的问题及展望20-21
• 试验研究21-46
• 第二章 奶山羊雄性生殖干细胞转录组比对分析21-28
• 2.1 实验材料和仪器21
• 2.1.1 实验动物和主要试剂21
• 2.1.2 主要仪器21
• 2.2 试验方法21-23
• 2.2.1 主要溶液配制21-22
• 2.2.2 奶山羊精原细胞的分离和免疫磁珠法分选22-23
• 2.2.3 奶山羊转录组文库构建及测序23
• 2.2.4 试验数据统计23
• 2.3 结果23-26
• 2.3.1 奶山羊CD49f阴、阳性精原细胞分选及检测23-24
• 2.3.2 奶山羊CD49f阴、阳性精原细胞测序结果评估24-25
• 2.3.3 Unigene物种注释分析25-26
• 2.4 讨论26-27
• 2.5 小结27-28
• 第三章 奶山羊精原干细胞转录组差异基因比较28-38
• 3.1 试验方法28-30
• 3.1.1 生物信息学分析主要数据库28
• 3.1.2 基因的差异表达分析28-29
• 3.1.3 GO聚类分析29-30
• 3.1.4 KEGG分析30
• 3.1.5 候选基因的功能富集分析30
• 3.1.6 实验数据统计处理30
• 3.2 结果30-37
• 3.2.1 奶山羊CD49f阴阳性精原细胞差异表达基因30-33
• 3.2.2 GO功能显著性分析33
• 3.2.3 代谢通路显著性分析33-37
• 3.3. 讨论37
• 3.4. 小结37-38
• 第四章 PAX7维持奶山羊雄性生殖干细胞的自我更新38-46
• 4.1 材料38-39
• 4.1.1 实验材料38
• 4.1.2 主要试剂38-39
• 4.1.3 主要仪器设备及耗材39
• 4.2 方法39-40
• 4.2.1 主要溶液配制39
• 4.2.2 Pax7基因的克隆39
• 4.2.3 Pax7在奶山羊睾丸组织中表达情况检测39-40
• 4.2.4 实验数据处理40
• 4.3 结果40-45
• 4.3.1 Pax7在奶山羊体内表达情况40-41
• 4.3.2 奶山羊Pax7基因鉴定及功能特性鉴定41-42
• 4.3.3 奶山羊Pax7基因功能分析42-45
• 4.4 讨论45
• 4.5 小结45-46
• 结论46
• 创新点46
• 进一步研究课题46-47
• 参考文献47-53
• 附录53-56
• 缩略词56-57
• 致谢57-58
• 作者简介58

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