表达猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性鉴定

发布时间：2017-08-13 04:29

  本文关键词：表达猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性鉴定

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【摘要】：猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原,在我国猪群中广泛存在,给养殖业造成严重经济损失。当前用于防控PCV2感染的疫苗主要包括灭活疫苗和亚单位疫苗。近年来,PCV2与伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)混合感染十分普遍,造成仔猪严重的呼吸系统疾病以及母猪繁殖障碍,新出现的PRV变异强毒株给临床防控提出新的挑战和难题。本研究以PRV为病毒活载体,将PCV2 Cap蛋白基因插入PRV基因组内,以期构建能够表达高水平PCV2 Cap蛋白的重组PRV病毒,旨在为这两种病毒性疫病的防控提供一种基因工程疫苗。研究表明,PRV胸苷激酶(TK)基因是病毒毒力相关基因,该基因缺失对病毒复制能力没有明显影响,但使其毒力大大降低。我们首选PRV TK基因作为靶点,在缺失该基因的同时替换插入PCV2 Cap基因,构建了一种表达PCV2 Cap蛋白基因的重组PRV TK缺失毒株。本研究构建了2个重组转移载体pMD18T-LR(TK)-EGFP和pMD18T-LR(TK)-Cap,前者包含缺失TK基因的左右同源臂和EGFP表达盒,后者包含缺失TK基因的左右同源臂和Cap蛋白表达盒。将pMD18T-LR(TK)-EGFP和PRV-JF毒株的基因组DNA共转染PK-15细胞,经同源重组方法用EGFP表达盒替换TK基因,经绿色荧光蚀斑筛选和PCR鉴定,筛选获得缺失TK基因的重组病毒rPRV-TK-/EGFP+。以该重组毒株为材料,经同源重组方法用PCV2 Cap表达盒再替换EGFP表达盒,经无绿色荧光蚀斑反式筛选和PCR鉴定,获得表达PCV2 Cap表达盒的重组病毒rPRV-TK-/Cap+。用PCV2 Cap蛋白特异性单克隆抗体进行IPMA方法鉴定PCV2 Cap蛋白的表达,结果检测不到Cap蛋白的表达,证实该重组毒株不能表达Cap蛋白,分析可能与插入的位点或者表达盒有关。为了进一步构建能高效表达PCV2 Cap蛋白的重组PRV,又以rPRV-TK-/Cap+重组病毒为材料,选择PRV gE基因为新的插入靶点。首先构建了2个重组转移载体pMD18T-LR(gE)-EGFP和pMD18T-LR(gE)-Cap(CI),前者包含缺失gE基因的左右同源臂和EGFP表达盒,后者包含缺失gE基因的左右同源臂和Cap蛋白表达盒。将重组转移载体pMD18T-LR(gE)-EGFP与重组病毒rPRV-TK-/Cap+基因组DNA共转染PK-15细胞,经同源重组方法用EGFP表达盒替换gE基因,通过绿色荧光蚀斑筛选和PCR鉴定,获得TK、gE双基因缺失的重组毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/EGFP+。以该重组毒为材料,将重组转移载体pMD18T-LR(gE)-Cap(CI)与其基因组DNA共转染PK-15细胞,经无绿色荧光蚀斑反向筛选和PCR鉴定,获得TK、gE双基因缺失含有两个Cap蛋白表达盒的重组毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CI)。经IPMA和Western blot试验检测Cap蛋白的表达水平,结果显示用Cap蛋白特异性单克隆抗体可以检测到Cap蛋白的表达,表明该重组病毒能有效地表达Cap蛋白。为了进一步增强Cap蛋白的表达量,本研究从改变Cap蛋白表达盒的启动子和优化Cap基因密码子两方面,经同源重组方法构建了携带Cap蛋白复合启动子表达盒的重组病毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CA)和携带Cap蛋白密码子优化表达盒的重组病毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+opti(CA)。经IPMA和Western blot检测结果表明,上述两种重组毒均可以有效地表达Cap蛋白,然而这3种重组毒株rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CI)、rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CA)和rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+opti(CA)Cap表达量的差异并不显著。一步PRV-JF的要弱。用构建的重组毒株接种家兔显示其毒力明显降低,表明对家兔是安全的,具备了作为疫苗研制的可能。UL42蛋白是PRV病毒DNA聚合酶的辅助亚基,对病毒复制是必需的。UL42的体外功能已被证实,有关UL42的单克隆抗体所识别的抗原表位到目前仍未见报道。本实验室制备了6株针对UL42蛋白的单抗(2D5、4E2、2G11、5F8、7C11和8F9),通过Western blot和ELISA方法对这些单抗识别的抗原表位进行了鉴定。结果显示,有两个区域的氨基酸(aa)(39~148 aa和302~384 aa)能与UL42单抗反应。通过合成一系列针对这两个区域的短肽,最终鉴定出了这6株单抗能够识别3个抗原表位,其中表位116SGGVLDALK124位于UL42的氨基端,而354KRPAAPR360和360RMYTPIAK367位于UL42的羧基端。氨基酸序列分析显示,这3个表位在不同的PRV毒株间是高度保守的。此外,用这些单抗建立的间接免疫荧光试验法检测到UL42蛋白在病毒的复制过程中定位于细胞核内;用这些单抗进行的免疫沉淀试验可将UL42蛋白从感染PRV的PK-15细胞中沉淀出来;用这些单抗还建立了一种新的IPMA方法可用于PRV病毒含量测定。因此,这些单抗在UL42蛋白结构和功能研究中提供了非常有用的工具。
【关键词】：猪圆环病毒2型 重组伪狂犬病病毒 Cap蛋白 抗原表位
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 英文缩略表13-14
• 第一章 绪论14-29
• 1.1 猪圆环病毒概况14-15
• 1.1.1 致病性14
• 1.1.2 病原学14-15
• 1.2 猪圆环病毒疫苗的研究进展15-20
• 1.2.1 灭活疫苗16
• 1.2.2 弱毒疫苗16-17
• 1.2.3 基因工程疫苗17-20
• 1.2.4 展望20
• 1.3 伪狂犬病病毒概况20-22
• 1.3.1 致病性20-21
• 1.3.2 病原学21-22
• 1.4 以PRV为载体的重组疫苗研究进展22-27
• 1.4.1 重组的PCV2/PRV的研究25
• 1.4.2 重组的PRRSV/PRV的研究25-26
• 1.4.3 重组的CSFV/PRV的研究26
• 1.4.4 重组的PPV/PRV的研究26
• 1.4.5 重组的FDMV/PRV的研究26-27
• 1.4.6 其它的重组的病毒27
• 1.4.7 展望27
• 1.5 研究目的和意义27-29
• 第二章 表达单个PCV2 Cap蛋白的重组PRV毒株的构建29-39
• 2.1 材料与方法29-35
• 2.1.1 毒株、质粒、菌株、细胞、主要试剂及其溶液的配制29-30
• 2.1.2 主要仪器设备30
• 2.1.3 PRV病毒的准备30
• 2.1.4 PRV病毒基因组的提取30-31
• 2.1.5 重组转移载体的构建及鉴定31-32
• 2.1.6 重组转移载体质粒的提取32-33
• 2.1.7 转染用细胞的准备33
• 2.1.8 转移载体pMD18T-LR(TK)-EGFP和PRV基因组共转染细胞33
• 2.1.9 TK基因缺失重组病毒的筛选、纯化与鉴定33-34
• 2.1.10 rPRV-TK-/EGFP+重组毒株基因组的提取34
• 2.1.11 表达单个Cap蛋白重组病毒的筛选、纯化与鉴定34-35
• 2.2 结果35-37
• 2.2.1 转移载体的构建35
• 2.2.2 TK基因缺失重组病毒rPRV-TK-/EGFP+的获得与鉴定35-36
• 2.2.3 表达单个Cap蛋白重组毒株的获得与鉴定36-37
• 2.3 讨论37-39
• 第三章 串联表达2个PCV2 Cap蛋白的重组PRV毒株的构建39-52
• 3.1 材料和方法40-44
• 3.1.1 试剂、质粒和抗体40
• 3.1.2 试验动物40
• 3.1.3 rPRV-TK-/Cap+病毒基因组的提取40
• 3.1.4 转移载体pMD18T-LR(gE)的构建与鉴定40-41
• 3.1.5 转移载体pMD18T-LR(gE)-EGFP的构建与鉴定41
• 3.1.6 含有Cap不同表达盒的转移载体的构建和鉴定41-42
• 3.1.7 重组转移载体质粒的提取42
• 3.1.8 转染用细胞的准备42
• 3.1.9 TK和gE基因缺失重组病毒的筛选、纯化与鉴定42
• 3.1.10 rPRV-TK-/Cap+/gE-/EGFP+病毒基因组的提取42
• 3.1.11 含有Cap不同表达盒的重组病毒的筛选、纯化与鉴定42-43
• 3.1.12 含有Cap不同表达盒的重组病毒的PCR与IPMA鉴定43-44
• 3.1.13 含有Cap不同表达盒的重组病毒的Western blot鉴定44
• 3.1.14 含有Cap不同表达盒的重组病毒的一步生长曲线测定44
• 3.1.15含有Cap不同表达盒的重组病毒在家兔上的安全性试验44
• 3.2 结果44-49
• 3.2.1 转移载体的成功构建44-45
• 3.2.2 TK和gE基因缺失重组毒株的筛选与鉴定45-46
• 3.2.3 含有Cap不同表达盒的重组毒株的筛选与鉴定46-48
• 3.2.4 含有Cap不同表达盒的重组毒株的Western blot鉴定48
• 3.2.5 含有Cap不同表达盒的重组毒株的生长特性鉴定48-49
• 3.2.6 含有Cap不同表达盒的重组毒株对家兔的安全性试验49
• 3.3 讨论49-52
• 第四章 PRV UL42蛋白抗原表位的鉴定52-62
• 4.1 材料和方法52-56
• 4.1.1 质粒、试剂及抗体52-53
• 4.1.2 抗原表位的鉴定53-55
• 4.1.3 对抗原表位的分析55
• 4.1.4 单抗序列的测定55
• 4.1.5 UL42单克隆抗体的应用55-56
• 4.2 结果56-60
• 4.2.1 UL42单克隆抗体特性的鉴定56-59
• 4.2.2 UL42单克隆抗体的应用59-60
• 4.3 讨论60-62
• 第五章 全文结论62-63
• 参考文献63-69
• 致谢69-70
• 作者简历70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 刘丹;王一平;吴洪丽;危艳武;刘建波;李胜斌;魏萍;刘长明;;猪圆环病毒2型Rep/Rep'和Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护性试验[J];中国预防兽医学报;2013年11期

2 刘长明;陆月华;郭龙军;危艳武;;猪圆环病毒疫苗的研究进展[J];兽医导刊;2012年02期

3 刘长明;危艳武;陆月华;黄立平;吴洪丽;张朝霞;温士刚;姜凤娟;;猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)的研制与应用[J];畜牧兽医科技信息;2010年09期

4 田志军;仇华吉;倪健强;周艳君;蔡雪辉;周国辉;王云峰;童光志;;表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特性分析(英文)[J];遗传学报;2005年12期

5 吕建强,陈焕春,赵俊龙,方六荣,何启盖,熊符;表达猪细小病毒VP_2基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特征研究[J];病毒学报;2004年02期

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本文编号：665406