TLR4在母牛分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞中作用的初步研究

发布时间：2017-08-14 02:30

  本文关键词：TLR4在母牛分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞中作用的初步研究

  更多相关文章： 母牛分枝杆菌 巨噬细胞 TLR4 MAPK NF-κB

【摘要】：非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacterium,NTM)广泛存在于自然界中,是不同于麻风分枝杆菌、结核杆菌复合群的另一种分枝杆菌。由于最近几年NTM在感染的动物和人体组织内的分离率逐渐升高,引起人们的广泛重视。结核分枝杆菌入侵机体之后感染的主要细胞是巨噬细胞。当细菌入侵机体时,可通过Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)介导巨噬细胞使丝裂原蛋白激酶信号激活,最后使核转录因子(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)激活,刺激多种细胞因子释放,调节机体的细胞免疫应答。目前关于NTM的研究主要集中在流行病学的调查、细菌耐药性分析、细菌鉴别和疾病诊断方面,而对于NTM的致病机制研究这方面却相对较少。母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)是非结核分枝杆菌的一种,为探讨NTM是否通过TLR调控炎症反应和介导相关信号通路的转导,本研究通过母牛分枝杆菌进行了以下工作:首先,将从临床牛的肠系膜淋巴结中分离出的母牛分枝杆菌,重新培养并进行菌种鉴定。建立母牛分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,利用荧光定量PCR技术与流式细胞术检测菌株对小鼠巨噬细胞RAW264.7刺激后TLR4表达量的变化,再利用ELISA技术测定细菌感染前后细胞上清中TNF-α和IFN-γ的表达量的变化。实验结果表明:母牛分枝杆菌感染可上调小鼠巨噬细胞RAW264.7 TLR4表达量,并且随时间其表达量发生改变;母牛分枝杆菌感染可上调小鼠巨噬细胞RAW264.7中TNF-α和IFN-γ表达。这一结果预测母牛分枝杆菌可能通过TLR4介导小鼠巨噬细胞RAW264.7中细胞因子的表达。采用ELISA方法测定母牛分枝杆菌刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7 6h后不同细胞因子IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的表达情况。结果表明:母牛分枝杆菌感染可激活小鼠巨噬细胞RAW264.7上调IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α等细胞因子的表达;TLR4阻断剂预处理后,继续测定相关细胞因子的表达量变化。结果显示:TLR4阻断剂能够显著抑制母牛分枝杆菌诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 IL-4和IL-10细胞因子的表达,同时检测到IL-1β表达量显著增高,而IFN-γ和TNF-α的表达并无明显变化,这一结果表明母牛分枝杆菌诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7表达IL-4和IL-10的过程可能是依赖TLR4完成的,并且TLR4的激活可能对于IL-1β的表达产生抑制。同时,采用荧光定量PCR技术和免疫印迹试验(Western Blot)检测在母牛分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7过程中,RAW264.7细胞内信号通路中关键分子mRNA和蛋白表达量的变化情况,探讨其是否激活RAW264.7细胞MAPK信号通路和NF-κB信号通路的转导。实验结果表明:母牛分枝杆菌感染可上调小鼠巨噬细胞RAW264.7中MyD88mRNA、TRAF6mRNA和NF-κBm RNA表达水平,其中TRIFm RNA表达低于对照组;母牛分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7使ERK1/2、p38、JNK和NF-κB信号信号通路激活,显著上调相应蛋白磷磷酸化水平。随后利用TLR4阻断剂对细胞进行预处理,探讨母牛分枝杆菌激活小鼠巨噬细胞RAW264.7相关信号通路传导是否通过TLR4介导。实验结果表明:TLR4阻断剂可抑制细胞内MyD88mRNA和TRAF6mRNA表达,上调NF-κBm RNA表达,TRIFmRNA表达无显著变化;TLR4阻断剂可显著降低母牛分枝杆菌诱导的ERK1/2和p38磷酸化水平,JNK磷酸化水平无明显改变,NF-κB蛋白表达水平显著上调。以上结果预示着母牛分枝杆菌可能激活MyD88依赖性和MyD88非依赖性信号传导途径,并且通过TLR4介导ERK1/2和p38信号通路的激活,但TLR4的激活可能抑制母牛分枝杆菌感染的小鼠巨噬细胞RAW264.7中NF-κB信号通路的激活。综上所述,本实验首次以母牛分枝杆菌初步探讨了非结核分枝杆菌与巨噬细胞相互作用的研究。结果发现,母牛分枝杆菌感染可诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7上调细胞因子表达以及激活相关信号通路传导,并且这些过程可能通过依赖TLR4介导实现。本研究将为揭示机体抗NTM感染相关机制的研究提供科学数据,为进一步研究NTM病的免疫机制提供一定的理论基础。
【关键词】：母牛分枝杆菌 巨噬细胞 TLR4 MAPK NF-κB
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-10
• 第一篇 文献综述10-21
• 1 非结核分枝杆菌概述10-13
• 2 TLRS在宿主抗结核分枝杆菌感染中发挥的免疫机制13-18
• 3 与 MTB 感染有关的主要细胞因子18-21
• 第二篇 研究内容21-58
• 第一章 母牛分枝杆菌感染对小鼠巨噬细胞TLR4和细胞因子表达的影响21-40
• 1.1 材料和方法21-28
• 1.2.结果28-38
• 1.3 讨论38-39
• 1.4 小结39-40
• 第二章 TLR4在母牛分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞中作用的研究40-58
• 2.1 材料和方法40-44
• 2.2 结果44-55
• 2.3 讨论55-57
• 2.4 小结57-58
• 结论58-59
• 参考文献59-68
• 作者简介68-69
• 致谢69

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张天民;关于牡牛分枝杆菌译名的商榷[J];微生物学通报;1995年01期

2 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 罗永艾;;母牛分枝杆菌(微卡)菌苗治疗肺结核一年随访结果[A];中华医学会第六届全国结核病学术大会论文汇编[C];2000年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 何屹;母牛分枝杆菌有助提高学习能力[N];科技日报;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 齐花蕊;浅黄分枝杆菌和母牛分枝杆菌感染鼠的细胞免疫变化规律研究[D];吉林农业大学;2015年

2 赵明明;TLR4在母牛分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞中作用的初步研究[D];吉林农业大学;2016年

，

本文编号：670313