IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究

发布时间：2017-08-19 20:03

  本文关键词：IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究

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【摘要】：羊口疮病毒(Orf virus,Orf V)属于痘病毒科、副痘病毒属成员,为有囊膜线性双股DNA病毒,是引起绵羊、山羊发生以口唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤、黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡以及结成疣状厚痂为主要特征的接触性、嗜上皮性、人兽共患传染病病原。羊口疮在养羊的国家和地区普遍发生,常呈群发性流行,是严重威胁养羊业、具有重要经济意义的病毒病。疫苗接种是防控病毒性疫病可靠且有效的手段,Orf常用疫苗有弱毒、灭活疫苗,但在生产实践中羊口疮弱毒苗存在散毒危险、毒力返强等缺陷,灭活苗存在灭活不彻底、产生抗体水平较低等缺陷。因此,运用基因工程技术开发Orf新型疫苗具有重要意义。Orf V诱导机体以细胞免疫为主,而IL-2是Th1型细胞因子,可作为细胞因子免疫佐剂,与核酸疫苗联用能增强其免疫效果。本研究构建了山羊IL-2基因、Orf V B2L基因和F1L基因三种真核表达质粒,将山羊IL-2基因真核表达质粒作为细胞因子佐剂与Orf V真核表达质粒联合免疫小鼠,探讨山羊IL-2细胞因子佐剂对Orf V核酸疫苗免疫效果的影响研究。主要研究内容如下:1.山羊IL-2基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达:采集健康贵州黑山羊外周血,分离培养淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,通过RT-PCR扩增、序列测定获得山羊IL-2基因序列,并对其进行生物信息学分析;以p VAX1为真核表达载体,构建山羊IL-2基因真核表达质粒,采用质粒PCR、双酶切和测序鉴定;将重组质粒转染MDBK细胞,采用RT-PCR和ELISA方法对其转录、瞬时表达进行鉴定。结果表明,贵州黑山羊IL-2基因完整编码阅读框长468 bp,编码155个氨基酸,与Gen Bank中羊源IL-2基因序列相比,核苷酸序列一致性为95.9%-100%,氨基酸序列一致性为91.1%-100%;将羊IL-2基因序列提交Gen Bank,获得登录号KT934548;生物信息学预测,该蛋白α-螺旋与β-折叠较多,有信号肽,无跨膜结构和特定功能结构域,整条肽链表现为亲水性;经质粒PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建了真核表达质粒p VAX1-IL-2;p VAX1-IL-2转染MDBK细胞48 h后的上清,RT-PCR检测到IL-2基因的m RNA转录,ELISA方法检测到MDBK细胞上清IL-2蛋白浓度约为112 pg/m L。2.羊口疮病毒B2L、F1L基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达:根据Gen Bank收录的Orf V基因序列(No.AY386264),分别设计针对Orf V B2L、F1L基因引物,通过PCR扩增、序列测定获得B2L、F1L基因序列,并对其进行生物信息学分析;以p VAX1为真核表达载体,构建B2L、F1L基因真核表达质粒,采用质粒PCR、双酶切和测序鉴定;将重组质粒转染MDBK细胞,采用RT-PCR和IFA方法对其转录、瞬时表达进行鉴定。结果表明,Orf V-GZ株B2L基因全长1137 bp,与Gen Bank中B2L基因序列相比,其核苷酸序列一致性为97.3%-98.8%,氨基酸序列一致性为97.1%-99.7%;F1L基因全长1029 bp,,与Gen Bank中F1L基因序列相比,其核苷酸序列一致性为96.0%-99.6%,氨基酸序列一致性为95.5%-99.7%;分别将Orf V-GZ株B2L、F1L基因提交Gen Bank,获得登录号KP994595、KP057582;生物信息学分析,B2L基因编码蛋白α-螺旋和β-折叠较多,整条肽链表现为疏水性,无跨膜结构和信号肽,含2个磷脂酶D超家族保守结构域,同时还有相应的特异性结合位点;F1L基因编码蛋白α-螺旋和β-折叠较多,整条肽链表现为疏水性,含2个跨膜结构,无信号肽。经质粒PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建真核表达质粒p VAX1-B2L、p VAX1-F1L;RT-PCR方法检测转染细胞中有B2L、F1L基因m RNA转录,IFA方法检测到B2L、F1L基因在MDBK细胞中表达。3.IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果影响研究:以p VAX1-IL-2作为细胞因子佐剂,分别与p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L联合免疫小鼠,采用ELISA方法对小鼠血清中Orf V特异性抗体与Th1型(IL-2、IFN-γ、TNF-α)和Th2型(IL-4、IL-6、IL-10)细胞因子进行测定;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;FACS法检测小鼠脾淋巴细胞亚群变化。结果表明,p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L三组质粒均具有良好免疫原性,各真核质粒免疫组1周后均能诱导小鼠产生Orf V特异性抗体,第6周时抗体水平最高,第7周时抗体水平开始下降,其中以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组抗体变化趋势明显;MTT法检测结果表明三组质粒诱导的淋巴细胞增殖反应均高于p VAX1和PBS组,差异极显著(P0.01),加入p VAX1-IL-2佐剂组与未加入佐剂组相比,差异极显著(P0.01),表明p VAX1-IL-2对三组质粒诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖具有促进作用,在1~4周能够持续增殖;FACS结果表明p VAX1-B2L、p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-IL-2、p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组的CD3+CD4+T淋巴细胞含量较PBS组与p VAX1组高,以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组最高,且加p VAX1-IL-2细胞因子佐剂组高于未加佐剂组,CD4+T细胞含量高于CD8+T细胞含量,CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值介于1.71~2.94之间,表明各真核质粒免疫组均能诱导淋巴细胞亚类增殖,辅助性T细胞高于抑制性T细胞,重组质粒不会引起小鼠不良反应;细胞因子检测结果表明,Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)含量高于Th2型(IL-4、IL6、IL-10),且加入p VAX1-IL-2佐剂组高于未加佐剂组,表明细胞免疫以Th1型为主。结论:本试验成功克隆了贵州黑山羊IL-2基因,Orf V-GZ株B2L基因和F1L基因,生物信息学分析表明三个基因具有良好抗原性。本实验构建了三种真核表达质粒p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L和p VAX1-F1L。p VAX1-IL-2对p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L在小鼠体内诱导的Orf V特异性体液免疫和细胞免疫具一定的促进作用,细胞免疫应答以Th1型为主。
【关键词】：IL-2 基因佐剂 羊口疮病毒 核酸疫苗 免疫效果
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-14
• 前言14-15
• 文献综述115-24
• 文献综述224-32
• 第一章 山羊IL-2 基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达研究32-55
• 1 材料32-33
• 1.1 主要材料32
• 1.2 主要试剂32
• 1.3 主要仪器32-33
• 2 方法33-43
• 2.1 山羊IL-2 基因克隆与序列分析33-39
• 2.2 山羊IL-2 基因生物信息学分析39
• 2.3 山羊IL-2 基因真核表达质粒构建与表达39-43
• 3 结果43-52
• 3.1 山羊IL-2 基因克隆及序列分析结果43-47
• 3.2 山羊IL-2 基因生物信息学分析结果47-50
• 3.3 山羊IL-2 基因真核表达质粒鉴定结果50-52
• 4 讨论52-54
• 4.1 关于山羊IL-2 基因克隆及生物信息学分析52-53
• 4.2 关于真核表达质粒载体的选择53
• 4.3 关于pVAX1-IL-2 在MDBK细胞中的表达53-54
• 5 小结54-55
• 第二章 羊口疮病毒(OrfV) B2L、F1L基因真核表达质粒的构建与表达研究55-80
• 1 材料55-56
• 1.1 主要材料55-56
• 1.2 主要试剂56
• 1.3 主要仪器56
• 2 方法56-60
• 2.1 OrfV B2L、F1L基因克隆与序列分析56-58
• 2.2 OrfV B2L、F1L基因的生物信息学分析58
• 2.3 OrfV B2L、F1L基因真核表达质粒构建与表达58-60
• 3 结果60-77
• 3.1 OrfV B2L、F1L基因的克隆及序列分析结果60-67
• 3.2 OrfV B2L、F1L基因的生物信息学分析结果67-74
• 3.3 OrfV B2L、F1L基因真核表达质粒鉴定结果74-77
• 4 讨论77-79
• 4.1 关于OrfV核酸疫苗目的基因的选择77
• 4.2 关于OrfV B2L与F1L基因的生物信息学分析77-78
• 4.3 关于OrfV pVAX1-B2L和pVAX1-F1L在MDBK细胞中的转录和表达78-79
• 5 小结79-80
• 第三章 IL- 2 基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究80-122
• 1 材料81
• 1.1 实验动物81
• 1.2 实验材料81
• 1.3 主要试剂81
• 1.4 主要仪器81
• 2 方法81-86
• 2.1 pVAX1-IL-2、pVAX1-B2L和pVAX1-F1L质粒制备81-82
• 2.2 实验动物(KM系)免疫试验82-83
• 2.3 免疫小鼠血清中特异性抗体水平检测83
• 2.4 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验83-84
• 2.5 免疫小鼠脾脏T淋巴细胞亚类变化84-85
• 2.6 免疫小鼠血清中Th1/ Th2型细胞因子检测85-86
• 3 结果86-116
• 3.1 免疫小鼠血清中特异性抗体水平动态变化结果86-90
• 3.2 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果90-94
• 3.3 免疫小鼠脾脏T淋巴细胞亚类分析结果94-97
• 3.4 免疫小鼠血清中Th1/Th2型细胞因子检测结果97-116
• 4 讨论116-121
• 4.1 关于IL-2 基因佐剂对核酸疫苗免疫效果的影响116-118
• 4.2 关于OrfV核酸疫苗诱导免疫反应118-120
• 4.3 关于免疫检测指标的选择120-121
• 5 小结121-122
• 全文结论122-123
• 参考文献123-129
• 附录一 攻读硕士期间发表论文情况129-130
• 附录二 攻读硕士期间取得的成果130-136
• 附录三 主要培养基、溶液及试剂配制136-137
• 致谢137-138

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本文编号：702663