猪瘟病毒非编码区结构功能研究

发布时间：2017-08-19 23:00

  本文关键词：猪瘟病毒非编码区结构功能研究

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【摘要】：猪瘟(Classical swine fever,CSF)是一种高传染性、高致病性和高致死率的病毒性传染病,危害猪和野猪。猪瘟因其发病特点,给许多国家的养猪业都造成了极大的经济损失,因此猪瘟被世界动物卫生组织列为A类法定传染病。猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种病毒性传染病,该病毒是黄病毒科、瘟病毒属的一员。CSFV是一种单股正链的RNA病毒,外层有囊膜结构,病毒粒子直径为40~60 nm,其基因组大小约为12.3 kb。CSFV基因组结构主要由三部分组成,依次为5’非编码区(5’untranslated region,5’UTR)、能够编码约3900个氨基酸残基的多聚蛋白的开放阅读框(ORF)和3’非编码区(3’untranslated region,3’UTR)。其中,5’UTR和3’UTR在病毒基因组RNA复制和翻译中都起到了重要的作用。将CSFV强毒株Shimen株和弱毒株HCLV进行序列比对,发现弱毒株HCLV在3’UTR的58到69位点之间插入了12个核苷酸序列,这是造成CSFV毒力强弱的一个重要因素。在本实验中,用双荧光素酶报告基因检测系统进行CSFV非编码区结构功能的研究。分别构建了Shimen株和HCLV株的5’UTR和3’UTR调节的荧光素酶表达载体,并进行比对分析。结果显示,弱毒株HCLV的5’UTR和3’UTR对荧光素酶表达抑制作用不及强毒株Shimen,说明CSFV毒性的强弱确实与非编码区相关。为了研究CSFV 3’UTR在调节猪瘟病毒翻译过程中的作用机制,本实验对3’UTR进行了一系列的截短研究。发现其抑制翻译作用的区域主要位于核苷酸80-106区间,该区域富含AU,即ARE结构域。通过生物信息技术分析发现,在ARE下游的112-139位点有潜在的microRNA ssc-let-7结合处。实验结果显示,单独的ssc-let-7结合区不能对3’UTR产生明显的抑制作用,但ARE-let7对3’UTR的抑制效果会显著增强,说明ssc-let-7可能只有在ARE存在的情况下,才能有协同抑制猪瘟病毒翻译的作用。由于ARE缺失会增强3’UTR的抑制作用,暗示宿主细胞中有些蛋白结合于此处调节猪瘟病毒的翻译,降低ARE区对病毒翻译的抑制。本研究表明HuR就是这样一种蛋白。当HuR蛋白过表达时,ARE对翻译的抑制效果明显减弱。反之,当把HuR蛋白干涉后,发现ARE对荧光素酶的表达的抑制作用增强。由此可知,宿主细胞中的HuR与CSFV3’UTR区的ARE结合后,能增强CSFV的翻译作用。总之,猪瘟病毒3’UTR能抑制其在宿主细胞中的翻译,而且ARE区在其调节病毒的翻译过程中起着最主要的作用。猪瘟病毒也能雇佣一些宿主细胞的蛋白,如HuR来调节其蛋白的翻译。
【关键词】：猪瘟 猪瘟病毒 非编码区 ARE结构域 HuR蛋白
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 综述10-17
• 1 猪瘟及猪瘟病毒概述10-11
• 1.1 猪瘟10
• 1.2 猪瘟病毒10-11
• 2 猪瘟病毒非编码区的结构功能11-14
• 2.1 5’UTR12-13
• 2.2 3’UTR13-14
• 3 RNA结合蛋白HuR与ARE结构域的关系14-17
• 3.1 RNA结合蛋白HuR14-15
• 3.2 ARE结构域15
• 3.3 RNA结合蛋白HuR与ARE的关系15-17
• 第一部分 猪瘟病毒石门株和C株非编码区功能比对17-40
• 1 材料17-20
• 1.1 载体、菌株和细胞17
• 1.2 主要试剂17-18
• 1.3 溶液配制18-20
• 1.4 主要仪器设备20
• 2 方法20-34
• 2.1 引物设计及合成20-21
• 2.2 重组质粒pMIR-SM3、pMIR-SM5的构建21-29
• 2.3 重组质粒PMIR-C3、PMIR-C5的构建29-32
• 2.4 猪肾细胞PK-15的复苏和培养32-33
• 2.5 PK-15细胞转染33-34
• 2.6 双荧光素酶活性检测34
• 3 结果34-38
• 3.1 重组质粒PMIR-SM3、PMIR-SM5鉴定34-36
• 3.2 重组质粒pMIR-C3、pMIR-C5鉴定36-38
• 3.3 猪瘟病毒Shimen株和C株非编码区功能比较38
• 4 讨论38-40
• 第二部分 猪瘟病毒石门株 3' UTR对蛋白翻译的调控40-66
• 1 材料40
• 2 方法40-51
• 2.1 引物设计及合成40-41
• 2.2 质粒构建41-50
• 2.3 PK-15细胞的复苏和培养50-51
• 2.4 PK-15细胞转染51
• 2.5 双荧光素酶活性检测51
• 3 结果51-64
• 3.1 1-111区在 3’UTR中起关键作用51-53
• 3.2 30-111区在 3’UTR中起关键作用53-55
• 3.3 54-106区在 3’UTR中起关键作用55-56
• 3.4 ARE区显著影响荧光素酶表达56-58
• 3.5 ARE缺失降低 3’UTR对翻译的抑制功能58-60
• 3.6 ARE能与let7协同作用60-64
• 4 讨论64-66
• 第三部分 HuR对猪瘟病毒 3' UTR的调节66-79
• 1 材料66-68
• 1.1 载体、菌株和细胞66
• 1.2 主要试剂66
• 1.3 溶液配制66-68
• 2 方法68-73
• 2.1 引物设计及合成68
• 2.2 RNA的提取68-69
• 2.3 RT-PCR69
• 2.4 真核表达载体pCMV-HA-HuR的构建69
• 2.5 细胞转染69
• 2.6 Western bloting69-71
• 2.7 HuR siRNA的设计及合成71-72
• 2.8 Real time RT-PCR72-73
• 2.9 双荧光素酶活性检测73
• 3 结果73-77
• 3.1 HuR过表达降低 3’UTR的翻译抑制作用73-75
• 3.2 HuR干涉增强 3’UTR的翻译抑制作用75-77
• 4 讨论77-79
• 结论79-80
• 附录80-84
• 参考文献84-89
• 致谢89

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本文编号：703357