褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其机制的探究

发布时间：2017-08-20 22:12

  本文关键词：褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其机制的探究

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【摘要】：褪黑素是松果腺分泌的一种多功能分子,它不仅能调节昼夜节律和季节性动物繁殖,而且在调节动物生殖方面也起着重要的作用。研究证明,褪黑素对卵泡的发育、卵母细胞的成熟和胚胎发育起着重要的作用。本研究主要是探讨外源性褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟的影响,并对其相关作用机制进行探究,以期进一步优化卵母细胞体外成熟的培养体系,为阐明水牛卵母细胞成熟的机制提供一定的理论依据。首先,检测了水牛卵丘细胞和卵母细胞上褪黑素的两种受体MT1和MT2的表达情况。结果发现,在水牛卵丘细胞和卵母细胞上均存在褪黑素受体MT1和MT2。其次,探究了在体外成熟培养液中添加不同浓度褪黑素(0M、10-9M、10-8M、10-7M)对水牛卵母细胞体外成熟及其随后体外受精胚胎的发育的影响。结果显示：水牛卵母细胞在添加不同浓度的褪黑素(10-9M、10-8M、10-7M)的成熟液中成熟培养22-24h后,每个处理组的卵母细胞第一极体排出率均显著高于未添加组(50.30% vs 47.56%、53.04% vs 47.56%、50.63% vs47.56%,P0.05),且浓度为10-8M组卵母细胞的极体排出率显著高于10-9M和10-7M组(P0.05)。随后,将各组成熟培养24 h后的卵母细胞进行体外受精,发现受精后各处理组胚胎的分裂率显著高于未添加组(60.23% vs57.62%、65.26% vs 57.62%、62.84% vs 57.62%,P0.05),而且10-8M和10-7M组的胚胎能发育到囊胚的比例显著高于未添加组(20.48% vs15.22%、18.68 vs 15.22%,P0.05),但10-9M组的囊胚发育率与未添加组相比差异不显著(16.44% vs 15.22%,P0.05)。最后,探讨了褪黑素对卵母细胞成熟影响的作用机制。结果发现：在成熟液中单独添加同等浓度的褪黑素受体拮抗剂(LZU,10-8M),水牛卵母细胞成熟培养后的极体排出率(47.44% vs 48.15%)、体外受精后胚胎分裂率(57.18% vs 58.42%)和囊胚率(15.06% vs 15.26%)与未添加组相比,差异不显著(P0.05)；而单独添加同等浓度的褪黑素受体激动剂(IIK7,10-8M)时,水牛卵母细胞成熟培养后的极体排出率(51.25% vs 48.15%)、体外受精后胚胎分裂率(64.15% vs 58.42%)和囊胚率(19.04% vs 15.26%)均显著高于未添加组(P0.05),但与单独添加褪黑素组(MT,10-8M)卵母细胞的极体排出率(51.25% vs 52.94%)、体外受精后胚胎的分裂率(61.24% vs 64.32%)和囊胚率(18.52% vs 19.36%)相比,差异不显著(P0.05)；当同时添加褪黑素(MT,10-8M)和褪黑素受体拮抗剂(LZU，，10-8M)时,水牛卵母细胞成熟后的极体排出率(48.19% vs 48.15%)、体外受精后胚胎的分裂率(58.13% vs 58.42%)和囊胚率(15.23% vs 15.26%)与未添加组相比,差异不显著(P0.05)。对卵母细胞活性氧进行检测,结果发现褪黑素处理组卵母细胞成熟后细胞内的活性氧含量显著低于未添加的对照组(P0.05)。利用激光共聚焦显微镜检测卵母细胞线粒体的分布和线粒体膜电位的变化情况,结果显示：褪黑素处组水牛卵母细胞线粒体呈扩散型分布的数量及线粒体的膜电位均显著高于未添加组(P0.05)。利用酶标检测cAMP、cGMP、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶含量的变化,发现褪黑素处理组的卵母细胞内cAMP的含量显著低于未添加组,而cGMP、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的含量显著高于未添加组(P0.05)。荧光定量PCR检测抗氧化基因GPX4和SOD1、卵丘扩展相关基因PTX3 和 HAS1、HAS2以及褪黑素受体基因MT1和MT2的表达情况,结果显示：经褪黑素处理能显著上调水牛卵母细胞GPX4、SOD1、MT1和MT2的表达,而且也显著上调了卵丘细胞上卵丘扩展相关基因PTX、HAS1、HAS2以及褪黑素受体基因MT1和MT2的表达水平(P0.05)。上述结果表明：(1)在水牛卵丘细胞和卵母细胞上均存在褪黑素受体MT1和MT2;(2)在水牛成熟液中添加适当浓度(10-8M)的褪黑素有利于水牛卵母细胞体外成熟以及其胚胎发育潜能的获得；(3)褪黑素能抑制卵母细胞cAMP的合成、促进卵母细胞cGMP的合成,同时上调卵丘扩展相关基因PTX、HAS1、HAS2口上调受体基因MT1、MT2的表达；(4)褪黑素能促进卵母细胞中抗氧化物酶的合成,清除细胞活性氧,并上调抗氧化物酶的基因表达。
【关键词】：水牛卵母细胞 体外成熟 褪黑素 受体 作用机制
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823.83
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 第一部分 文献综述14-32
• 1 哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究进展15-25
• 1.1 前言15
• 1.2 卵子的发生的过程15-18
• 1.2.1 卵原细胞的形成和增殖15-16
• 1.2.2 卵母细胞的形成和生长16
• 1.2.3 卵母细胞的成熟16-17
• 1.2.4 卵母细胞的成熟调控17-18
• 1.3 卵母细胞的体外成熟18-22
• 1.3.1 卵母细胞的采集方法19-20
• 1.3.2 卵母细胞的体外成熟质量的评定20
• 1.3.3 卵母细胞体外成熟的方法20-22
• 1.4 影响卵母细胞体外成熟的因素22-25
• 1.4.1 动物的种类22
• 1.4.2 动物的年龄22
• 1.4.3 动物的生产性能22
• 1.4.4 卵母细胞的形态和类型22-23
• 1.4.5 卵泡的大小和形态23
• 1.4.6 卵丘细胞23
• 1.4.7 颗粒细胞23-24
• 1.4.8 卵巢贮存温度和时间24
• 1.4.9 激素24-25
• 2 褪黑素的研究进展25-31
• 2.1 褪黑素简介25-26
• 2.2 褪黑素的合成26
• 2.3 褪黑素的功能简介26-28
• 2.4 褪黑素对颗粒细胞的影响28
• 2.5 褪黑素对卵母细胞体外培养的影响28-29
• 2.6 褪黑素对胚胎体外培养的影响29
• 2.7 褪黑素对线粒体的影响29-30
• 2.8 褪黑素的作用机制和受体的信号通路30-31
• 3 目的与意义31-32
• 第二部分 试验研究32-62
• 第一章 褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育的影响33-43
• 1 材料与方法34-38
• 1.1 材料34-35
• 1.1.1 组织材料34
• 1.1.2 主要仪器设备34
• 1.1.3 主要试剂34
• 1.1.4 主要溶液的配制34-35
• 1.2 试验方法35-37
• 1.2.1 水牛卵母细胞的收集及体外成熟培养35-36
• 1.2.2 水牛卵母细胞的体外受精(IVF)36
• 1.2.3 水牛早期胚胎体外培养(IVC)36-37
• 1.2.4 水牛COCs和水牛卵母细胞免疫荧光染色37
• 1.3 试验设计37
• 1.4 数据处理分析37-38
• 2 结果38-40
• 2.1 褪黑素受体在卵丘细胞和卵母细胞上的表达分析38-39
• 2.2 成熟液中添加不同浓度褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟的影响39-40
• 2.3 成熟液中添加不同浓度褪黑素对水牛卵母细胞后续胚胎发育能力的影响40
• 3 分析与讨论40-42
• 4 小结42-43
• 第二章 褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟作用机制的探究43-62
• 1 材料与方法44-50
• 1.1 材料44-46
• 1.1.1 组织材料44
• 1.1.2 主要仪器设备44
• 1.1.3 主要试剂44
• 1.1.4 主要溶液的配制44-46
• 1.1.5 引物合成46
• 1.2 试验方法46-49
• 1.2.1 水牛COCs的收集与体外成熟培养46
• 1.2.2 水牛卵母细胞的体外受精(IVF)46
• 1.2.3 水牛早期胚胎体外培养(IVC)46-47
• 1.2.4 水牛卵母细胞成熟前后活性氧的检测47
• 1.2.5 水牛卵母细胞成熟前后线粒体膜电位和线粒体分布检测47
• 1.2.6 水牛卵母细胞成熟前后cAMP、cGMP和抗氧化物酶的检测47-48
• 1.2.7 水牛颗粒细胞的收集及基因组的提取和反转录48
• 1.2.8 水牛卵母细胞的微量反转48-49
• 1.2.9 实时荧光定量PCR49
• 1.3 试验设计49-50
• 1.4 统计分析50
• 2 结果50-58
• 2.1 褪黑素受体拮抗剂、褪黑素受体激动剂和褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟的影响50-51
• 2.2 褪黑素受体拮抗剂、褪黑素受体激动剂和褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟受精后胚胎发育能力的影响51-52
• 2.3 褪黑素对水牛卵母细胞成熟后活性氧含量的影响52-53
• 2.4 褪黑素对水牛卵母细胞成熟后线粒体分布和线粒体膜电位的影响53-55
• 2.4.1 褪黑素对水牛卵母细胞成熟后线粒体分布的影响53-54
• 2.4.2 褪黑素对水牛卵母细胞成熟后线粒体膜电位的影响54-55
• 2.5 褪黑素对水牛卵母细胞成熟后cAMP和cGMP含量的影响55-56
• 2.6 褪黑素对水牛卵母细胞成熟后过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶含量的影响56
• 2.7 褪黑素对水牛卵母细胞成熟后相关基因MRNA表达量的影响56-58
• 3 分析与讨论58-61
• 4 小结61-62
• 全文结论62-63
• 参考文献63-68
• 英文缩略词68-69
• 致谢69-70

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