热应激需求蛋白HtrA在副猪嗜血杆菌应激及粘附中的作用研究

发布时间：2017-08-21 03:04

  本文关键词：热应激需求蛋白HtrA在副猪嗜血杆菌应激及粘附中的作用研究

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【摘要】：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)为格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)的病原,为定殖于健康猪上呼吸道的条件致病菌,在某些条件下能够侵入机体并引发猪的多发性、系统性疾病。热应激需求蛋白(high temperature requirement A)Htr A家族是一类在单细胞和多细胞生物中高度保守的蛋白酶,在蛋白质质量控制过程中极为重要。在许多病原菌当中,htr A编码的热应激需求蛋白与其自身生存及毒力密切相关。本课题主要研究了副猪嗜血杆菌中Htr A对于其在应激条件下的自身存活及对宿主细胞粘附能力的影响,取得的主要结果如下:1.Nagasaki-Δhtr A缺失株的构建及鉴定构建重组质粒p K18mobsac B-htr A-UKD自然转化至副猪嗜血杆菌血清5型参考菌株Nagasaki中,并以kan抗性筛选得到htr A缺失突变株Nagasaki-Δhtr A。通过PCR、RT-PCR、Southern blot等鉴定方法,证明htr A基因缺失株构建成功。2.Nagasaki野生株与Nagasaki-Δhtr A缺失株环境适应性比较将Nagasaki与Nagasaki-Δhtr A分别在37℃及40℃培养并绘制生长曲线,结果表明在37℃及40℃条件下缺失菌株的生长曲线受到不同程度的影响,且40℃时缺失菌株的生长显著减缓,活菌数降低。在p H6.5及p H8.5的条件下培养并绘制生长曲线,结果表明偏酸性条件下两株菌的生长曲线均受到显著影响,而在偏碱性条件下两株菌的生长曲线受影响程度较小,对数期时同一时间点时缺失株的OD600值低于野生株,证明缺失株环境适应性较野生株弱。扫描电镜观察结果发现缺失株的菌体表面较野生株光滑。3.副猪嗜血杆菌中Htr A与菌株的抗吞噬及粘附能力、血清抗性相关与猪肺泡巨噬细胞(3D4/2)互作后显示Nagasaki-Δhtr A抗吞噬能力显著高于野生菌株。与猪肾上皮细胞(PK-15)及猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)互作后显示Nagasaki-Δhtr A的粘附指数在0.5h、1.5h、2.5h三个时间点时显著低于Nagasaki野生株。加入原核表达的Htr A后Nagasaki野生株对猪肾上细胞(PK-15)的粘附能力显著增强。血清抗性试验结果表明,在缺失htr A基因之后Nagasaki的血清抗性显著提高。4.荧光定量实验筛选存活、粘附相关差异表达基因选出副猪嗜血杆菌与细菌粘附侵入、热休克、血清抗性有关的基因进行相对荧光定量实验,在37℃条件下,htr A基因的缺失会显著下调rfa E、thy A、cdt B、nan H、rfa F基因的表达,这些基因与副猪嗜血杆菌的粘附定殖能力相关,和之前粘附能力显著下降的表型一致。而较显著上调表达的有ops X基因和clp P基因,分别与血清抗性及热休克相关;40℃时htr A基因的缺失所下调表达的基因也主要是与粘附相关,另外两个热休克相关基因deg S、clp P也下调表达。证明htr A的缺失影响到了重要相关功能基因的表达。综上,本研究发现热应激需求蛋白Htr A与副猪嗜血杆菌应激耐受、粘附能力、抗吞噬、血清抗性等相关。
【关键词】：副猪嗜血杆菌 热应激需求蛋白HtrA 应激应答 粘附
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 缩略词表（Abbreviation）11-12
• 1. 文献综述12-21
• 1.1 副猪嗜血杆菌概述12-15
• 1.1.1 副猪嗜血杆菌流行病学及致病机理12-13
• 1.1.2 副猪嗜血杆菌的重要功能基因13-15
• 1.2 HtrA研究进展15-21
• 1.2.1 HtrA的结构及作用方式15-17
• 1.2.2 HtrA的功能17-19
• 1.2.3 病原菌中的HtrA19-21
• 2. 研究目的与意义21-22
• 3. 材料与方法22-42
• 3.1 实验材料22-28
• 3.1.1 菌株、质粒、细胞22
• 3.1.2 实验所用酶、试剂及试剂盒22-23
• 3.1.3 培养基及抗生素的配制23
• 3.1.4 主要溶液的配制23-25
• 3.1.5 主要仪器25-26
• 3.1.6 引物26-28
• 3.2 实验方法28-42
• 3.2.1 重组自杀性质粒的构建28-31
• 3.2.2 自然转化筛选基因缺失突变株Nagasaki-ΔHtrA::kan31-32
• 3.2.3 ΔhtrA基因缺失株的鉴定32-35
• 3.2.4 菌株生长曲线测定35-36
• 3.2.5 扫描电镜观察细菌菌体36
• 3.2.6 3D4/2 细胞吞噬实验36-37
• 3.2.7 细胞粘附实验37
• 3.2.8 血清抗性实验37-38
• 3.2.9 His-HtrA蛋白的诱导表达及纯化38-40
• 3.2.10 HtrA蛋白功能研究40-41
• 3.2.11 荧光定量实验41-42
• 4. 结果与分析42-55
• 4.1 重组自杀质粒的构建42-43
• 4.2 ΔHtrA基因缺失株的鉴定43-45
• 4.2.1 PCR鉴定43
• 4.2.2 RT-PCR验证基因缺失和极性效应检测43-44
• 4.2.3 Southern blot鉴定44-45
• 4.3 菌株生长曲线测定45-47
• 4.3.1 不同温度条件下的生长曲线的测定45-47
• 4.3.2 不同p H条件下的生长曲线的测定47
• 4.4 扫描电镜观察细菌菌体47-48
• 4.5 3D4/2 细胞吞噬实验48
• 4.6 细胞粘附实验48-50
• 4.6.1 PK-15 细胞粘附实验48-49
• 4.6.2 PIEC细胞粘附实验49-50
• 4.7 血清抗性实验50
• 4.8 His-HtrA蛋白的诱导表达及纯化50-51
• 4.9 HtrA蛋白功能研究51-53
• 4.9.1 HtrA蛋白对上皮钙黏蛋白（E-cadherin）的切割实验51-52
• 4.9.2 HtrA的免疫原性及反应原性检测52
• 4.9.3 HtrA促进菌株对PK-15 细胞的粘附52-53
• 4.10 荧光定量实验53-55
• 5. 讨论55-59
• 5.1 自然转化法构建HtrA缺失突变株55
• 5.2 HtrA的缺失影响副猪嗜血杆菌应激状态下的存活能力55-56
• 5.3 HtrA的缺失影响副猪嗜血杆菌抗 3D4/2 吞噬能力及血清抗性56
• 5.4 HtrA的缺失影响副猪嗜血杆菌对细胞的粘附能力56-57
• 5.5 副猪嗜血杆菌HtrA蛋白功能的研究57-58
• 5.6 副猪嗜血杆菌HtrA的缺失所影响的重要功能基因58-59
• 6. 结论59-60
• 参考文献60-67
• 附录67-69
• 致谢69

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