禽源鲍曼不动杆菌的分离鉴定与OmpA蛋白的原核表达及其初步应用

发布时间：2017-08-21 03:00

  本文关键词：禽源鲍曼不动杆菌的分离鉴定与OmpA蛋白的原核表达及其初步应用

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【摘要】：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii,Ab)是医院内分离率位居第二的常见于人类感染的非发酵菌。其常会造成严重的医院内感染,包括皮肤和软组织的感染、伤口感染、泌尿系统感染、继发性脑膜炎、呼吸机相关性肺炎和菌血症等并导致人类死亡。然而对于动物源鲍曼不动杆菌引起的动物感染或者带菌情况的报道远远没有人类多,尤其禽类感染鲍曼不动杆菌的情况鲜有报道,故探明其在禽类的感染率或者有否人源菌株感染禽类等流行病学情况具有重要的现实和公共卫生意义。本课题首次开展了不动杆菌在家禽中感染情况的调查研究,并对流行菌株进行系统发育分析。此外,通过对外膜蛋白A(OmpA)进行原核表达,分析其免疫原性,并基于此建立了间接ELISA方法,以及进行了初步应用。本研究对2014年9月至2015年10月的发病蛋鸡的肝脏、脾脏、肺、气管和十二指肠等450份病料进行鲍曼不动杆菌的分离鉴定。对分离菌进行了形态特征、培养特性的观察、生化试验、药敏试验、小鼠致病性试验和特异性基因检测,结果共分离到2株鲍曼不动杆菌,流行率仅0.44%(95%CI,0.1-1.6)。2株鲍曼不动杆菌均对多种抗生素耐药,且对小鼠有较强的致病性,LD50均达到7.09×107CFU/0.5 m L。这为研究鲍曼不动杆菌对禽类的致病性以及其感染的流行情况等提供了材料基础。为了更好的认识禽源鲍曼不动杆菌的遗传进化地位及其溯源,本研究基于管家基因rec A、gyr B、rpo B结合16S r RNA基因对2株禽源分离株进行系统发育分析。结果表明,进化树分析发现2株禽源分离株与人源鲍曼不动杆菌遗传距离最近,与大肠杆菌遗传距离最远,核苷酸同源性分析显示禽源分离菌核苷酸同源性均与人源鲍曼不动杆菌的最高,高达92%-99.9%。以上结果说明禽源分离菌可能由人源菌株进化而来,这显示了重要的公共卫生意义。证明了rec A、gyr B、rpo B基因联合16S r RNA基因可用于不动杆菌属菌种鉴定,探索了一种鉴定该菌的新方法。通过设计特异性引物,扩增OmpA基因,克隆至原核表达载体p ET28a(+),构建重组质粒p ET28a-OmpA,转化至BL21菌体进行诱导表达。通过条件摸索,确定最佳诱导条件,之后采用琼脂糖Ni柱纯化重组蛋白,并对其进行Western blot分析。SDS-PAGE结果表明,在37℃经0.4 mmol/L IPTG诱导5 h的条件下,重组菌株能表达出约41 k Da的融合蛋白,与预期大小一致。Western blot分析显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。以上结果为进一步建立快速简便的免疫学检测方法和进行血清流行病学调查奠定基础。以纯化的OmpA蛋白作为抗原进行包板,建立了针对抗鸡鲍曼不动杆菌抗体的间接ELISA检测方法。本文所建立的ELISA方法具有良好的重复性和特异性,对来自河南不同地市的399份鸡血清进行鲍曼不动杆菌抗体的检测,结果显示阳性率有3.75%。本研究所建立的ELISA方法可用于临床样品的血清学检测,并为鸡群中鲍曼不动杆菌的临床诊断和流行病学调查提供了有效的检测方法。
【关键词】：鲍曼不动杆菌 流行病学 系统发育分析 OmpA蛋白 间接ELISA
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 致谢4-9
• 英文缩写词表9-10
• 摘要10-11
• 文献综述11-22
• 1.1 不动杆菌的发现11
• 1.2 生长与培养特性11-12
• 1.3 流行病学调查12-15
• 1.4 鲍曼不动杆菌的毒力因素15-18
• 1.5 鲍曼不动杆菌诊断方法研究进展18-21
• 1.6 小结21-22
• 试验研究22-58
• 试验一 禽源鲍曼不动杆菌的分离鉴定22-29
• 1.1 材料22-23
• 1.1.1 病料来源及实验动物22
• 1.1.2 培养基和主要试剂22-23
• 1.2 方法23-24
• 1.2.1 病原菌的分离培养与纯化23
• 1.2.2 细菌生化鉴定23
• 1.2.3 特异性基因检测23
• 1.2.4 细菌药敏试验23
• 1.2.5 小鼠致病性试验23-24
• 1.3 结果24-26
• 1.3.1 细菌培养特性和镜检结果24-25
• 1.3.2 生化试验结果25
• 1.3.3 特异性基因检测25
• 1.3.4 药敏试验结果25-26
• 1.3.5 小鼠致病性试验26
• 1.4 讨论26-29
• 试验二 禽源鲍曼不动杆菌的系统发育分析29-42
• 2.1 材料29-30
• 2.1.1 菌株29
• 2.1.2 主要仪器29
• 2.1.3 主要试剂29-30
• 2.2 方法30-31
• 2.2.1 引物设计30
• 2.2.2 细菌DNA的提取30
• 2.2.3 管家基因的PCR扩增30-31
• 2.2.4 管家基因的序列测定和分析31
• 2.2.5 基于管家基因的系统发育树构建和同源性分析31
• 2.3 结果31-38
• 2.3.1 管家基因的PCR扩增31-32
• 2.3.2 PCR扩增产物的鉴定和测序结果32
• 2.3.3 基于4个管家基因的系统发育分析32-35
• 2.3.4 基于4个管家基因的同源性分析35-38
• 2.4 讨论38-42
• 试验三 禽源鲍曼不动杆菌OmpA基因的原核表达和免疫原性分析42-52
• 3.1 材料42-43
• 3.1.1 菌株，质粒和试验动物42
• 3.1.2 主要仪器42-43
• 3.1.3 主要试剂43
• 3.2 方法43-45
• 3.2.1 引物的设计与合成43
• 3.2.2 细菌DNA的提取43
• 3.2.3 OmpA基因的扩增及序列分析43-44
• 3.2.4 原核表达载体的构建44
• 3.2.5 重组蛋白的表达44
• 3.2.6 重组蛋白的纯化44-45
• 3.2.7 多克隆抗体的制备45
• 3.2.8 Western blot分析45
• 3.3 结果45-51
• 3.3.1 目的基因的扩增45-46
• 3.3.2 目的基因序列分析46-47
• 3.3.3 重组质粒pET28a-OmpA的双酶切鉴定47-48
• 3.3.4 重组蛋白的表达与纯化48-50
• 3.3.5 Western blot分析50-51
• 3.4 讨论51-52
• 试验四 基于禽源鲍曼不动杆菌OmpA蛋白的间接ELISA方法的建立及应用52-58
• 4.1.材料52-53
• 4.1.1 抗原与血清52
• 4.1.2 主要试剂和耗材52
• 4.1.3 主要仪器设备52
• 4.1.4 ELISA所需的试剂52-53
• 4.2 方法53-54
• 4.2.1 阳性血清的制备53
• 4.2.2 抗原的纯化53
• 4.2.3 最佳抗原包被浓度和血清最佳稀释度的确定53-54
• 4.2.4 最佳包板时间和温度的确定54
• 4.2.5 最佳二抗稀释比例的确定54
• 4.2.6 间接ELISA临界值判断标准的确定54
• 4.2.7 间接ELISA的特异性分析54
• 4.2.8 间接ELISA的重复性试验54
• 4.2.9 间接ELISA的初步应用54
• 4.3 结果54-56
• 4.3.1 OmpA重组蛋白的纯化54-55
• 4.3.2 最佳抗原包被浓度和血清最佳稀释度55
• 4.3.3 最佳抗原包被时间和温度55
• 3.3.4 最佳二抗稀释比例55
• 4.3.5 临界值判断标准的确定55
• 4.3.6 特异性分析55-56
• 4.3.7 重复性试验56
• 4.3.8 初步应用56
• 4.4 讨论56-58
• 全文总结58-59
• 参考文献59-72
• 附：作者读研期间发表文章72-73
• ABSTRACT73-74

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1 陶庆春;警惕鲍曼不动杆菌[N];健康报;2006年

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7 许攀峰;多重耐药鲍曼不动杆菌基因组与“耐药岛”的比较基因组学研究[D];浙江大学;2012年

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9 魏振波;鲍曼不动杆菌外膜蛋白A1S_0115A的克隆、表达及免疫保护性研究[D];第三军医大学;2015年

10 卢灵锋;多重耐药鲍曼不动杆菌耐药基因及分子流行病学研究[D];四川医科大学;2015年

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