检测犬弓形虫感染ELISA和胶体金试纸条方法的建立

发布时间：2017-08-21 02:34

  本文关键词：检测犬弓形虫感染ELISA和胶体金试纸条方法的建立

  更多相关文章： 犬 弓形虫 ELISA 胶体金 试纸条

【摘要】：弓形虫属于细胞内寄生原虫。弓形虫病是一类由弓形虫引起的对绝大多数脊椎动物包括人在内的具有严重危害的人兽共患疾病。弓形虫可以自然感染人、犬等是数百种动物。由于犬数量庞大,且与人的关系最为密切,所以犬弓形虫感染率与人的感染率息息相关。针对弓形虫病的研究技术众多,但因免疫学诊断方法敏感性高、特异性强、简便实用,所以应用广泛。本研究以犬作为研究对象,利用免疫学诊断技术建立检测犬弓形虫感染的方法。本试验成功建立了以SAG3重组蛋白为抗原用以检测犬血清弓形虫SAG3抗体的间接ELISA方法;和用42#抗弓形虫SAG3单抗为捕获抗体、29#抗弓形虫SAG3单抗作为检测抗体的检测犬弓形虫CAg的双抗体夹心ELISA的方法;以及用42#抗弓形虫SAG3单抗为捕获抗体、29#抗弓形虫SAG3单抗作为检测抗体用以检测犬弓形虫CAg的胶体金试纸条方法。3个试验得到的结果如下:1.犬弓形虫感染的间接ELISA检测方法的建立。借助于棋盘滴定法确定抗原的包被浓度和阳性血清稀释度;再对该方法的封闭剂以及封闭时间、犬弓形虫阳性血清孵育的时间、二抗的工作浓度以及显色液的孵育时间等各项条件进行优化;并采用优化后ELISA方法检验其敏感性;借助于犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清检测该ELISA方法的特异性;同时检验该ELISA方法的重复性;运用所建立的间接ELISA方法对87份样品血清进行检测。结果如下,该间接ELISA最佳优化条件分别是:抗原的包被浓度和阳性血清稀释度分别为0.82μg/孔,阳性血清稀释度1:20;封闭剂为10%胎牛血清的PBST溶液;最佳封闭时间和阳性血清作用时间分别为2 h和1.5 h;兔抗犬酶标二抗稀释度1:8000;底物最佳显色孵育时间为10 min。优化的ELISA敏感性为1:1280;与犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清之间均无交叉反应;批内批间重复性试验的变异系数均于15%以下。经该ELISA方法对所有样品血清检测可得血清阳性率为18.39%(16/87)。2.检测犬弓形虫感染双抗体夹心ELISA方法的建立。利用HRP标记试剂盒标记29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体即检测抗体并检测标记结果;借助于棋盘滴定法确定42#抗弓形虫SAG3单抗即捕获抗体的包被浓度和参考阳性血清的稀释度;再对该方法的封闭剂以及封闭剂的作用时间、犬弓形虫参考阳性血清孵育的时间、检测抗体的工作浓度以及显色液的孵育时间等各项条件进行优化;随后采用优化后ELISA方法检验其敏感性;采用犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清检测该ELISA方法的特异性;同时检验该ELISA方法的重复性,ELISA包被板保存4oC中,分别于15d、30d、60d以及90d后取出检测其稳定性;用所建立的双抗体夹心ELISA方法对76份样品血清进行检测。结果如下,本试验成功标记检测抗体;该方法最佳优化条件分别是:捕获抗体的包被浓度和参考阳性血清的稀释度分别为1∶800稀释(0.34μg/孔)和1∶12;封闭剂为10%胎牛血清的PBST溶液;最佳封闭时间和CAg血清作用时间均为2 h;检测抗体稀释度1∶3000。优化的ELISA敏感性为1∶48;与犬心丝虫阳性血清、犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清及犬巴贝斯虫阳性血清之间均无交叉反应;批内批间重复性试验的变异系数均于15%以下;保存于4oC中的ELISA包被板稳定性至少可达到90 d以上;经该双抗体夹心ELISA方法对76样品血清检测可得检出率为5.26%(4/76)。3.犬弓形虫感染胶体金试纸条的研制。该试验主要对金标蛋白pH值、硝酸纤维膜的选择、弓形虫参考阳性血清稀释度以及试纸条检测线T线和质控线C线条件的等条件进行优化;并采用优化的胶体金试纸条方法检验其敏感性;采用犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清检测该胶体金试纸条方法的特异性;同时检验该方法的重复性;再用所建立的胶体金试纸条方法对76份样品血清进行检测,并与建立的双抗体夹心ELISA所检测样品结果进行比较。结果如下,该胶体金试纸条方法最佳优化条件分别为:0.02 M K2CO3 4μL;密理博135 NC膜为最佳选择且流速大约为40 mm/7 min;参考阳性血清工作浓度为1∶8;T线、C线抗体稀释度均为0.5μg/μL;优化的胶体金试纸条方法的敏感性为1∶64;与犬心丝虫阳性血清、犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清及犬巴贝斯虫阳性血清与弓形虫参考阳性血清均无特异性反应;批内批间重复性较好。用胶体金试纸条方法检测76份样品血清样本,结果显示检出率为5.26%(4/76)。通过与双抗体夹心ELISA检测的检出率5.26%(4/76)相比较,结果显示两种试验方法对犬弓形虫血清CAg诊断相符率100%,说明该胶体金试纸条方法可靠性强,兼备简便、快速的优点,更适于在基层推广使用。
【关键词】：犬 弓形虫 ELISA 胶体金 试纸条
【学位授予单位】：天津农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.292
【目录】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-15
• 前言15-16
• 第一章 文献综述16-29
• 1.1 弓形虫病的研究进展16-24
• 1.2 弓形虫相关蛋白质的研究进展24-28
• 1.3 本研究的目的及意义28-29
• 第二章 犬弓形虫感染间接ELISA检测方法的建立29-43
• 2.1 材料29-32
• 2.2 方法32-35
• 2.3 结果35-40
• 2.4 讨论40-41
• 2.5 小结41-43
• 第三章 检测犬弓形虫感染双抗体夹心ELISA方法的建立43-55
• 3.1 材料43-44
• 3.2 方法44-47
• 3.3 结果47-52
• 3.4 讨论52
• 3.5 小结52-55
• 第四章 犬弓形虫感染胶体金试纸条的研制55-67
• 4.1 材料55-56
• 4.2 方法56-59
• 4.3 结果59-64
• 4.4 讨论64-65
• 4.5 小结65-67
• 全文结论67-69
• 参考文献69-73
• 致谢73-75
• 附录 常用缩略语中英文对照表75-76
• 攻读学位期间发表的论文76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李筱鑫;王泽东;刘全;葛巍;王巍;魏峰;;重组微线体MIC10的牛弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立[J];中国兽医学报;2015年03期

2 贾艳;陈玉环;杨丽娜;刘跃生;;犬弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立[J];中国畜牧兽医;2014年07期

3 李倩;张莉;李海龙;;非人灵长类弓形虫病研究进展[J];中国人兽共患病学报;2014年05期

4 马亮;任保彦;左绍志;宫鹏涛;李建华;张国才;杨举;张西臣;;刚地弓形虫RH株SAG3蛋白抗体检测的ELISA方法建立[J];安徽农业科学;2012年15期

5 马亮;刁玉梅;任保彦;宫鹏涛;李建华;张西臣;;弓形虫RH株表面抗原SAG3去信号肽基因的蛋白原核表达及鉴定[J];吉林农业大学学报;2012年01期

6 杨雯;万孝玲;田春林;王卫群;刘晓泉;;弓形虫表面抗原SAG4基因的克隆、表达和鉴定[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2009年04期

7 张居作;陈汉忠;徐君飞;;我国弓形虫的感染现状[J];动物医学进展;2008年07期

8 魏庆宽;李瑾;付婷霞;崔勇;柏雪莲;王用斌;黄炳成;韩广东;刘克义;;抗弓形虫P30单克隆抗体的制备及其抗虫作用观察[J];现代免疫学;2006年06期

9 于咏兰;高海;汪明;;北京地区家养犬猫胃肠道寄生虫病原学调查[J];中国兽医杂志;2006年10期

10 周永安;马艳萍;李荣山;尚丽红;;SAG3基因在肾移植患者弓形虫感染诊断中的应用[J];中国中西医结合肾病杂志;2006年02期

中国硕士学位论文全文数据库 前5条

1 刘原源;犬细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体的制备及初步应用[D];吉林大学;2015年

2 陈凌娟;云南大理HIV阳性者感染弓形虫B1、GRA6、SAG3基因位点的研究[D];大理学院;2014年

3 荆振宇;基于rROP18-rSAG2犬弓形虫ELISA检测技术及药物筛选研究[D];中国农业科学院;2011年

4 朱冠虹;弓形虫SAG1基因原核表达与间接ELISA检测方法的建立[D];扬州大学;2009年

5 卓国荣;犬血清弓形虫IgG抗体快速诊断金标试纸条的研制[D];华中农业大学;2008年

，

本文编号：710355