田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶Prx1和Prx的鉴定及功能分析

发布时间：2017-08-25 22:17

  本文关键词：田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶Prx1和Prx的鉴定及功能分析

  更多相关文章： 田鼠巴贝斯虫 过氧化物氧化还原蛋白 原核表达 酶活性分析

【摘要】：最近几年,田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)已成为一个新型的人类病原体,也是世界上的许多地区人类巴贝斯虫病的主要病原体。虫体内的过氧化物氧化还原酶(Peroxiredoxins,Prxs)是细胞中一类表达丰富的蛋白质。Prxs蛋白家族和其它抗氧化蛋白酶,如SOD,Gpx,Trx及Trx R一样在保护虫体内的生物大分子免受不利因素的影响方面发挥着重要作用。Prxs还原过氧化氢主要依赖其高度保守的具有氧化还原活性的Cys。Prxs蛋白被划分为Prx1,Prx5,Prx6,TPX,Prx Q和Ahp E六个亚科,本实验中研究的是其中的Prx1和Prx Q。虽然这种寄生虫的Prxs基因组已被测序和注释,但其生物性特性尚不清楚。本实验通过分子生物学技术获得了Prx1和Prx Q全长序列基因,其中Prx1全基因序列长度为594bp,具有一个编码194个氨基酸的开放阅读框(ORF),该蛋白无信号肽,利用软件推测Prx1的蛋白大小约为23 k Da。Prx Q全基因序列长度为537bp,具有一个编码194个氨基酸的ORF,其ORF中有一个信号肽序列,利用软件推测Prx Q的蛋白大小约为21 k Da。我们也成功构建了以p ET-30a为载体的重组质粒,并转化至BL21感受态细胞中的原核表达系统。通过对诱导条件的摸索,确定在1m M IPTG诱导,200rpm,37℃摇床振荡培养12h时能获得大量的重组蛋白,并通过Prx1和Prx Q上清进一步纯化获得了纯度较高的重组蛋白,符合进一步实验的要求。Prx1和Prx Q重组蛋白活性分析表明证明Prx1和Prx Q蛋白都有活性,但Prx1蛋白活性更高。在构建重组质粒时我们发现,Prx Q的序列中有一段信号肽,可能这决定了Prx1和Prx Q在细胞中的分布位置不同,从而使两种蛋白发挥不同的功能。关于田鼠巴贝斯虫各种Prxs的具体作用,需要后续实验的进一步研究。另外,通过Western blot鉴定和间接免疫荧光实验(IFAT)分析证明已经成功制备了Prx1和Prx Q多抗血清,同时Western blot鉴定证明虫体Prx1和Prx Q天然蛋白在虫体中以单体的形式发挥抗氧化作用,且虫体在红细胞中分裂高峰时Prx1和Prx Q大量表达。IFAT证明Prx1和Prx Q天然蛋白大量存在与细胞浆中。本文以B.microti Prxs为重点,解析其生物学特征及功能,展望了B.microti Prxs的研究和应用前景,以期为研究B.microti的致病机理及研发原虫病疫苗提供参考,并为更深入的研究提供依据。
【关键词】：田鼠巴贝斯虫 过氧化物氧化还原蛋白 原核表达 酶活性分析
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 符号说明4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1.引言12-17
• 1.1 田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶（Prxs）的研究进展12-17
• 1.1.1 Prxs的结构与分类13-14
• 1.1.2 Prxs作用机制14-15
• 1.1.3 Prx的功能15-16
• 1.1.4 小结16-17
• 2 材料与方法17-37
• 2.1 试验材料17
• 2.2 主要试剂和仪器17-18
• 2.2.1 主要试剂17-18
• 2.2.2 主要仪器18
• 2.3 主要相关试剂配方18-24
• 2.3.1 基因克隆相关试剂配方18-20
• 2.3.2 SDS-PAGE相关试剂配方20-21
• 2.3.3 蛋白纯化相关试剂配方21-23
• 2.3.4 ELISA相关试剂配方23-24
• 2.3.5 提取RNA的相关试剂配方24
• 2.4 实验方法24-37
• 2.4.1 Prx1和Prx Q基因的克隆24-28
• 2.4.1.1 收集KM小白鼠红细胞中的田鼠巴贝斯虫虫体24-25
• 2.4.1.2 田鼠巴贝斯虫总RNA的提取25
• 2.4.1.3 田鼠巴贝斯虫总RNA的反转录25-26
• 2.4.1.4 Prx1和Prx Q保守片段的扩增26-27
• 2.4.1.4.1 引物设计26
• 2.4.1.4.2 Prx1和Prx Q保守片段的扩增26-27
• 2.4.1.5 PCR产物的胶回收纯化27-28
• 2.4.1.6 胶回收产物的连接和转化28
• 2.4.2 Prx1和Prx Q的原核表达28-33
• 2.4.2.1 构建重组质粒28-30
• 2.4.2.1.1 Prx1/p MD-18T、Prx Q/p MD-18T和p ET-30a空质粒的提取28-29
• 2.4.2.1.2 插入片段的扩增29-30
• 2.4.2.2 重组蛋白表达形式分析30-33
• 2.4.2.2.1 IPTG的诱导表达30
• 2.4.2.2.2 SDS-PAGE鉴定重组蛋白30-32
• 2.4.2.2.3 蛋白纯化32-33
• 2.4.3 多抗血清的制备33
• 2.4.4 抗体水平检测33-34
• 2.4.5 制备血涂片34
• 2.4.6 重组蛋白的表达鉴定34-36
• 2.4.6.1 重组蛋白的Western Blot鉴定34-35
• 2.4.6.2 重组蛋白的间接免疫荧光检测35-36
• 2.4.7 酶活性分析试验36-37
• 2.4.7.1 质粒保护试验36-37
• 2.4.7.2 硫氰酸铁法测Prx1催化H2O2的反应活性37
• 2.4.7.3 Prx抗氧化活性测定37
• 3、实验结果37-47
• 3.1 Prx1和Prx Q基因的克隆37-39
• 3.1.1 总RNA的提取37-38
• 3.1.2 保守片段的扩增38-39
• 3.2 Prx1和Prx Q的原核表达39-42
• 3.2.1 表达质粒的构建39-40
• 3.2.2 蛋白上清纯化40-41
• 3.2.3 抗体水平检测41-42
• 3.3 重组蛋白的表达鉴定42-44
• 3.3.1 重组蛋白的Western Blot鉴定42
• 3.3.2 重组蛋白的间接免疫荧光检测42-44
• 3.4 质粒保护试验44-45
• 3.5 硫酸氢铁法催化过氧化氢45-46
• 3.6 Prx抗氧化活性测定46-47
• 4 讨论47-51
• 5 总结51-52
• 参考文献52-57
• 致谢57

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 王中华;田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶Prx1和Prx的鉴定及功能分析[D];山东农业大学;2016年

，

本文编号：738440