猪IGF1基因启动子活性分析及其表达调控的相关研究

发布时间：2017-08-26 00:30

  本文关键词：猪IGF1基因启动子活性分析及其表达调控的相关研究

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【摘要】：胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF1)是胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factors,IGFs)系统的成员之一,其在动物生命活动过程中发挥着重要的作用。研究表明,IGF1能介导动物初生后生长激素(GH)对生长的调节作用,而GH位于生长轴的中心位置,是调节动物生长的主要激素。IGF1在许多细胞过程中发挥促有丝分裂的作用,体内外试验也证明IGF1能促进组织生长并且参与组织代谢活动。目前,已经有大量关于畜禽IGF1基因对生长速度和胴体性状等影响的研究,研究证明血浆IGF1水平与生长速度、采食量、胴体组成和肉质性状、繁殖性能等多种性状相关。在畜禽中对IGF1基因的研究结果,对进一步了解其作用机理和在动物遗传育种中进行应用打下良好的生物学基础。以前关于IGF1基因的研究更多关注的是其基因组水平的DNA多态性与生长及肉用性状的相关关系,大量的研究也验证了一些与生产性能相关的多态性位点。然而,生物个体的性状差异主要还是由基因表达水平的差异所决定,研究基因表达水平的差异可能会发现产生性状差异的主要原因。鉴于IGF1在动物生命活动过程中发挥重要的作用,认清它的作用机理对人类了解和调节生命过程以及改良畜禽品种、提高生产效益具有十分重要的意义,本研究运用启动子活性分析、ChIP、超表达、qRT-PCR等技术,从转录调控水平研究IGF1在猪成纤维细胞的表达调控机制,结果证实IGF1基因在猪成纤维细胞中可以是通过poly(dA:dT)tract、C/EBPα信号通路进行转录调控。研究结果将有助于进一步了解IGF1的分子调控机制,有助于深入了解其对猪生长发育的作用机制,进而为探索提高猪生长效率的分子基础提供重要依据。主要研究结果如下:1、克隆获得了IGF1基因+1(以网上公布的mRNA序列的第一个碱基为+1)前面2775bp的5′调控区。2、成功构建了猪IGF1基因启动子报告基因重组体,并转染猪胎儿成纤维细胞,结果表明,启动区-381/+2活性最高,同时推测在-381/-100区域存在顺式作用元件。3、成功构建了含不同基因型poly(dA:dT)tract的IGF1核心启动子的报告基因重组体,并转染猪胎儿成纤维细胞,结果表明,含有9-T、10-T、11-T的纯合poly(dA:dT)tract的IGF1核心启动子的活性呈依次增加的趋势,且含11-T的纯合poly(dA:dT)tract的IGF1核心启动子的活性显著高于含9-T、10-T的纯合poly(dA:dT)tract的IGF1核心启动子的活性(P0.05);而含12-T的纯合poly(dA:dT)tract的IGF1核心启动子的活性明显地减少,显著低于含11-T的纯合poly(dA:dT)tract的IGF1核心启动子的活性(P0.01)。4、通过共转染pcDNA3.1-C/EBPα和含不同基因型poly(dA:dT)tract的IGF1核心启动子的报告基因重组体,结果显示共转染后各IGF1启动子活性显著低于各同基因型而没有共转染的IGF1启动子活性,表明转录因子C/EBPα对含不同基因型poly(dA:dT)tract的IGF1基因的表达均具有负调控作用,而且共转染后各基因型IGF1启动子的活性相似,表明不同基因型的poly(dA:dT)tract对C/EBPα调控IGF1基因表达产生一定的影响,其中含11-T的IGF1基因的活性变化最显著,其次为含10-T的,再到含9-T、12-T的,其变化的程度与不同基因型的poly(dA:dT)tract对IGF1启动子活性的影响一致;超表达C/EBPα后,能够显著地抑制IGF1的转录,也表明C/EBPα对IGF1的转录具有较好的负调控功能。5、采用ChIP技术,证实C/EBPα可通过与IGF1启动子区-286和-1254位点的C/EBPα结合位点结合,参与IGF1基因的表达调控,从而抑制IGF1的表达。结合启动子活性分析结果,核心启动子-381/-100区域对IGF1的表达起基础转录作用,而C/EBPα则抑制IGF1的表达。
【关键词】：猪 IGF1 启动子 Poly(dA:dT)tract C/EBPα
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文缩写词8-13
• 1 前言13-26
• 1.1 养猪业的重要性13
• 1.2 IGF1基因的研究进展13-18
• 1.2.1 IGF1的研究历史13-14
• 1.2.2 IGF1基因的结构及定位14
• 1.2.3 IGF1基因的生物学功能14-15
• 1.2.3.1 IGF1促生长作用14-15
• 1.2.3.2 IGF1对胚胎发育的作用15
• 1.2.4 IGF1基因的表达量15-16
• 1.2.5 IGF1基因的多态性16-17
• 1.2.6 IGF1的调控17-18
• 1.2.6.1 IGFBPs的调控17-18
• 1.2.6.2 激素对IGF1的调控18
• 1.3 Poly(dA:dT) tract的研究进展18-22
• 1.3.1 Poly(dA:dT) tracts在体内的重要功能18-19
• 1.3.2 Poly(dA:dT) tracts在体内排斥核小体19-20
• 1.3.3 Poly(dA:dT) tracts拥有不寻常的结构与动态特性20-22
• 1.4 转录因子C/EBPα的研究进展22-25
• 1.4.1 C/EBPs的研究历史22-24
• 1.4.2 C/EBPα的调控机理24-25
• 1.5 研究目的及意义25
• 1.6 本研究的技术路线25-26
• 2 材料与方法26-52
• 2.1 实验材料26-31
• 2.1.1 供试样品26
• 2.1.2 主要仪器与设备26-27
• 2.1.3 主要试剂来源和配制27-30
• 2.1.3.1 酶类、试剂和试剂盒27
• 2.1.3.2 试剂的配置27-30
• 2.1.4 细胞株、菌株和质粒30
• 2.1.5 主要分子生物学软件与数据库30-31
• 2.2 实验方法31-52
• 2.2.1 基因组DNA和总RNA抽提31-33
• 2.2.1.1 基因组DNA的抽提31
• 2.2.1.2 总RNA抽提31-32
• 2.2.1.3 总RNA的DNase-Ⅰ处理32
• 2.2.1.4 总RNA检测及浓度测定32-33
• 2.2.2 总RNA反转录33
• 2.2.3 猪IGF1基因 5′调控区克隆33-38
• 2.2.3.1 猪IGF1基因 5′调控区扩增34
• 2.2.3.2 目的片段的回收和纯化34-36
• 2.2.3.3 目的片段的T载体克隆36-37
• 2.2.3.4 T-IGF1的质粒抽提37-38
• 2.2.4 猪IGF1基因启动子报告基因重组体的构建及活性分析38-44
• 2.2.4.1 启动子 5′端系列缺失报告基因重组体的构建38-40
• 2.2.4.2 猪IGF1基因缺失片段的PCR扩增40
• 2.2.4.3 各缺失片段PCR产物的回收40
• 2.2.4.4 缺失片段PCR产物和pGL3-basic载体双酶切40-41
• 2.2.4.5 酶切产物回收41
• 2.2.4.6 酶切产物的连接41
• 2.2.4.7 酶切连接产物的转化41
• 2.2.4.8 无内毒素质粒抽提方法41-42
• 2.2.4.9 各重组质粒纯化与检测42
• 2.2.4.10 猪胎儿成纤维细胞体外培养体系的建立42-43
• 2.2.4.11 瞬时转染43-44
• 2.2.4.12 荧光素酶报告基因活性检测44
• 2.2.5 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心启动子的报告基因重组体的构建及活性分析44-45
• 2.2.5.1 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心启动子的报告基因重组体的构建44
• 2.2.5.2 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心启动子片段的PCR扩增44-45
• 2.2.5.3 各启动子片段PCR产物的回收45
• 2.2.5.4 各启动子片段PCR产物和pGL3-basic载体双酶切45
• 2.2.5.5 酶切产物回收45
• 2.2.5.6 酶切产物的连接45
• 2.2.5.7 酶切连接产物的转化45
• 2.2.5.8 无内毒素质粒抽提45
• 2.2.5.9 猪胎儿成纤维细胞体外培养体系的建立45
• 2.2.5.10 瞬时转染45
• 2.2.5.11 荧光素酶报告基因活性检测45
• 2.2.6 猪IGF1基因相关转录因子鉴定45-52
• 2.2.6.1 C/EBPα超表达载体的构建45-52
• 2.2.6.1.1 引物设计及合成45-46
• 2.2.6.1.2 目的片段的回收和纯化46
• 2.2.6.1.3 PCR产物和pcDNA3.1 载体双酶切46
• 2.2.6.1.4 酶切产物的回收46
• 2.2.6.1.5 酶切产物的连接46
• 2.2.6.1.6 酶切连接产物的转化46-47
• 2.2.6.1.7 无内毒素质粒抽提47
• 2.2.6.1.8 猪胎儿成纤维细胞体外培养体系的建立47
• 2.2.6.1.9 pcDNA3.1- C/EBPα与含不同基因型poly(dA:dT) tract的P5报告基因重组体共转染47
• 2.2.6.1.10 超表达后mRNA水平的检测47-48
• 2.2.6.1.11 定量结果的数据分析处理48
• 2.2.6.1.12 C/EBPα干扰实验48-49
• 2.2.6.1.13 染色质免疫共沉淀(ChIP)49-52
• 3 结果与分析52-64
• 3.1 DNA提取结果52-53
• 3.2 总RNA提取结果53
• 3.3 猪IGF15′调控区序列获得53-54
• 3.4 猪IGF1基因启动子报告基因重组体的构建及活性分析54-58
• 3.4.1 猪IGF1基因启动子转录因子结合位点的预测54-55
• 3.4.2 启动子报告基因重组体的构建55
• 3.4.3 猪原代胎儿成纤维细胞的培养55-57
• 3.4.4 启动子活性分析57-58
• 3.5 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心启动子的活性分析58
• 3.6 猪IGF1基因核转录因子鉴定58-64
• 3.6.1 C/EBPα超表达载体构建58-59
• 3.6.2 pcDNA3.1-C/EBPα与含不同基因型poly(dA:dT) tract的P5报告基因重组体共转染59-60
• 3.6.3 pcDNA3.1-C/EBPα的超表达60-61
• 3.6.4 C/EBPα干扰实验61-63
• 3.6.5 IGF1基因启动子ChIP检测结果63-64
• 4 讨论与结论64-77
• 4.1 IGF1基因对动物机体的作用64
• 4.2 猪IGF1基因 5′调控区序列的获得64-65
• 4.3 猪IGF1基因启动子活性分析65-68
• 4.3.1 猪IGF1基因 5′调控区重要调控元件分析65-67
• 4.3.2 猪IGF1基因启动子活性分析67-68
• 4.4 Poly(dA:dT) tract对IGF1基因的调控68-71
• 4.5 C/EBPα对IGF1基因的调控71-73
• 4.6 Poly(dA:dT) tract对C/EBPα调控IGF1基因的影响73-75
• 4.7 结论75-77
• 致谢77-78
• 参考文献78-92
• 附录92-93

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 马红;;大白猪仔猪皮肤成纤维细胞系建立及生物学特征[J];华北农学报;2009年S1期

2 肖书奇;张嘉保;李爽;赵志辉;任文陟;赵中利;张树敏;戴立胜;高妍;李毅;;松辽黑猪IGF-Ⅰ基因外显子4多态性及与部分生产性能的关系[J];中国畜牧兽医;2007年02期

3 赵晓枫;徐宁迎;胡晓湘;李宁;;IGF1调控区微卫星座位对金华猪生长性能的影响[J];遗传;2007年02期

4 陈辉;李冰;冉丕鑫;;E-box元件对大鼠γ-GCS催化亚单位基因调控作用的组织特异性研究[J];广州医学院学报;2007年01期

5 潘登科;张运海;孙秀柱;李燕;吴常信;李宁;;供体细胞对猪体细胞克隆胚胎早期发育的影响[J];畜牧兽医学报;2006年04期

6 李加琪,陈赞谋,刘德武,刘小红,孙宝丽,凌飞,张豪,陈瑶生;IGF1基因对长白×蓝塘猪资源群生产性能的遗传效应分析(英文)[J];遗传学报;2003年09期

7 孙兴参,伊亚玲,刘颖,于玲珠,刘娣;猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用[J];东北农业大学学报;2002年03期

8 郭淑贞,童坦君,张宗玉;细胞衰老相关基因的探索[J];生物化学与生物物理进展;2001年04期

9 葛盛芳,赵茹茜,陈伟华,陈杰;绍兴蛋鸭和高邮鸭胚胎发育过程中激素水平的变化[J];南京农业大学学报;2000年01期

10 方美英,刘红林,姜志华,李齐贤,陈杰,吴彦宁;6个猪种胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因座位遗传多态性检测[J];畜牧与兽医;1999年01期

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本文编号：738651