猪源乳酸菌分离鉴定及初步应用

发布时间：2017-08-26 01:09

  本文关键词：猪源乳酸菌分离鉴定及初步应用

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【摘要】：本研究从雅安规模化猪场10日龄内健康仔猪粪便中分离并筛选出耐酸、耐胆盐、耐胰酶且产酸能力强的优良乳酸菌菌株,阐明了乳酸菌的抑菌机理和抑菌条件,成功研制出了适合生产上用于预防和治疗哺乳仔猪细菌性腹泻、改善仔猪断乳应激反应、促进仔猪生长和降低料肉比的优良乳酸菌制剂。对分离得到的13株乳酸菌进行常规细菌学和16S rRNA方法进行鉴定,确定YW-1、4、6、8和10株为唾液乳杆菌唾液亚种,YW-2、3、5、7、9、11和12株为唾液乳杆菌水杨素亚种,H109株为嗜酸乳杆菌。通过低酸性环境、高胆盐浓度和高胰蛋白酶条件下的生长存活试验及产酸能力鉴定试验,最终筛选出能在pH2.0酸性环境、0.3%胆盐和1.4%胰蛋白酶中存活,且产酸能力强的YW-7、YW-1和H1093株菌作为后续试验用菌株。乳酸菌与大肠杆菌混合培养体外抑菌试验证实,乳酸菌的抑菌作用具有种属、活菌浓度和pH值依赖性,其中,YW-7培养液的pH值降低速率最快,最低pH值可达3.29,抑菌能力最强,YW-1次之,H109最差。YW-7与大肠杆菌的菌液体积比为1：1、2：1和4：1混合培养时,分别在12 h、8h和4h时呈现完全抑制大肠杆菌生长的作用。在牛津杯法抑菌试验中,YW-7发酵上清液对大肠杆菌的抑制作用最强,抑菌圈直径可达13.08～20.14 mm,而YW-1和H109的抑菌作用较差,仅为12.32～18.24 mm和11.24～17.32 mm。此外,相同pH值的HCl对大肠杆菌无抑制作用,抑菌圈均为0；当HCl的pH值调至3.00时,对大肠杆菌的抑菌圈直径也仅为9.56 mm,抑菌效果远低于乳酸菌发酵上清液。这一结果表明,酸性环境有助于乳酸菌发挥其抑菌作用,但并非抑菌的唯一因素。气相色谱检测菌株产生有机酸的试验结果显示,分离的乳酸菌菌株能产生乳酸、苯乳酸、硬脂酸、脯氨酸、丙氨酸、乙酸、亮氨酸、甘氨酸、棕榈酸和维生素C,在产乳酸和苯乳酸性能上,YW-7YW-1H109。研究发现,培养24 h内,乳酸菌培养时间越长,培养液中乳酸和苯乳酸的含量越高。YW-7培养至24 h时,培养液中乳酸和苯乳酸的含量分别可达14.52 mg/mL和1.47 mg/mL o由于YW-7具有良好的产酸性能,故选择其作为后续生产应用研究的试验菌株。YW-7制作的乳酸菌制剂用于治疗和预防哺乳仔猪细菌性腹泻,其效果与抗生素相当,2-3天即可痊愈,而市售产品产品Ⅰ和产品Ⅱ均未表现出显著的预防效果,3组的腹泻率分别为7.15%、7.95%和12.2%,空白对照组为7%。3种微生态制剂灌喂哺乳仔猪10天后,YW-7组粪便中乳酸菌与大肠杆菌数量比极显著高于产品Ⅰ组、产品Ⅱ组和抗生素组(P0.01)；其增重率为103.57%,同样极显著高于产品Ⅰ组、产品Ⅱ组和抗生素组(P0.01)。试验结果证明,YW-7能有效治疗哺乳仔猪细菌性腹泻,显著改善仔猪的肠道环境并促进仔猪生长。断乳仔猪连续饲喂YW-7乳酸菌制剂15天后,无腹泻发生,而产品Ⅰ组、产品Ⅱ组和空白组分别为3%、7%和8.3%；同时,YW-7组仔猪增重率均极显著高于产品Ⅰ组、产品Ⅱ组和空白组(P0.01),料肉比仅为1.28,显著低于产品Ⅰ组、产品Ⅱ组和空白组的1.49、2.34和2.14(P0.05)。YW-7组试验猪只在饲喂至100天屠宰时,平均体重比其它3组高出5 kg左右。以上试验结果说明,YW-7菌株制备的乳酸菌制剂能预防仔猪断奶应激所造成的腹泻,尤其是能显著的促进仔猪生长并极大地降低料肉比。
【关键词】：乳酸菌 抑菌机理 仔猪 腹泻 增重
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 前言11-17
• 1.1 断乳仔猪消化道生理特点11-12
• 1.1.1 胃酸分泌不足,消化酶活性较低11
• 1.1.2 肠绒膜形态发生变化,吸收能力下降11
• 1.1.3 胃肠道微生物区系紊乱,容易发生腹泻11-12
• 1.2 仔猪腹泻发病机理和现状12
• 1.3 防治断乳仔猪腹泻的方法12-13
• 1.4 常见乳酸菌的分类13
• 1.5 乳酸菌发酵产生有机酸13-15
• 1.5.1 有机酸种类及抑菌作用13-14
• 1.5.2 有机酸抑菌作用机理14-15
• 1.6 乳酸菌在防治仔猪腹泻方面的应用15-16
• 1.7 乳酸菌制剂存在的问题16-17
• 1.7.1 产品的安全性、有效性16
• 1.7.2 产品单一,缺乏针对性16
• 1.7.3 产品不能与抗生素联用16
• 1.7.4 生产加工保存稳定性16-17
• 1.8 本研究的目的及意义17
• 2 试验材料17-18
• 2.1 试验样品、指示菌株及试验动物17
• 2.2 主要试剂及药品17-18
• 2.3 试验仪器18
• 3 试验方法18-26
• 3.1 乳酸菌的分离鉴定及优良乳酸菌菌株的筛选18-20
• 3.1.1 乳酸菌的分离18-19
• 3.1.2 乳酸菌的初步鉴定19
• 3.1.3 16S rDNA序列分析19-20
• 3.1.4 优良乳酸菌菌株的筛选20
• 3.2 乳酸菌抑制大肠杆菌生长繁殖的研究20-23
• 3.2.1 菌株的活化及培养20-21
• 3.2.2 自制培养基的筛选21-22
• 3.2.3 乳酸菌对产肠毒素大肠杆菌生长繁殖的抑制22
• 3.2.4 乳酸菌发酵上清液对大肠杆菌生长繁殖的抑制22-23
• 3.3 气相色谱-质谱联用分析发酵上清液中主要有机酸含量23-24
• 3.3.1 标准液和发酵上清液的预处理23
• 3.3.2 色谱条件23
• 3.3.3 质谱条件23
• 3.3.4 标准曲线的制备23
• 3.3.5 发酵上清液分析23-24
• 3.4 乳酸菌制剂应用效果的研究24-26
• 3.4.1 乳酸菌制剂制备和保存期试验24
• 3.4.2 乳酸菌预防和治疗哺乳仔猪腹泻、改善肠道菌群及促生长试验24-25
• 3.4.3 乳酸菌预防断乳仔猪腹泻及促生长试验25-26
• 4 试验结果26-48
• 4.1 乳酸菌的分离鉴定及优良乳酸菌菌株的筛选26-32
• 4.1.1 分离细菌的形态、染色及菌落形态26-27
• 4.1.2 生理生化特性观察27-28
• 4.1.3 16S rRNA鉴定28-29
• 4.1.4 耐酸试验29-30
• 4.1.5 耐胆盐试验30-31
• 4.1.6 耐胰酶试验31-32
• 4.1.7 分离菌产酸试验32
• 4.2 乳酸菌体外抑制产肠毒素大肠杆菌生长试验32-39
• 4.2.1 自制培养基的筛选32-35
• 4.2.2 乳酸菌与大肠杆菌混合培养35-39
• 4.2.3 乳酸菌发酵上清液抑制大肠杆菌生长试验39
• 4.3 气相色谱-质谱联用分析发酵上清液中乳酸和苯乳酸含量39-46
• 4.3.1 标准品气相色谱分析结果39-40
• 4.3.2 乳酸和苯乳酸标准曲线40-41
• 4.3.3 乳酸菌发酵上清液中主要有机酸含量测定41-46
• 4.4 乳酸菌制剂保存期试验46
• 4.5 乳酸菌制剂应用效果46-48
• 4.5.1 乳酸菌制剂预防和治疗哺乳仔猪细菌性腹泻、改道菌群及促生长效果46-47
• 4.5.2 乳酸菌预防断乳仔猪腹泻及促生长效果47-48
• 5 分析讨论48-54
• 5.1 乳酸菌的分离鉴定及优良乳酸菌菌株的筛选48-50
• 5.1.1 乳酸菌的分离鉴定48
• 5.1.2 优良乳酸菌菌株的筛选48-50
• 5.2 乳酸菌对产肠毒素大肠杆菌生长繁殖的抑制50-51
• 5.2.1 混合培养中乳酸菌对产肠毒素大肠杆菌的抑制50-51
• 5.2.2 乳酸菌发酵上清液对产肠毒素大肠杆菌的抑制作用51
• 5.3 乳酸菌抑菌物质的检测51-52
• 5.4 乳酸菌制剂生产应用效果评价52-54
• 5.4.1 乳酸菌制剂的保存52
• 5.4.2 乳酸菌预防和治疗哺乳仔猪细菌性腹泻、改善肠道菌群及促生长效果52-53
• 5.4.3 乳酸菌制剂预防断乳仔猪细菌性腹泻及促生长效果53-54
• 6 结论54
• 7 创新性54-55
• 参考文献55-63
• 致谢63-64
• 附录64-76

【参考文献】

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本文编号：738712