民猪FoxN1基因序列及组织表达特征分析

发布时间：2017-08-26 07:18

  本文关键词：民猪FoxN1基因序列及组织表达特征分析

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【摘要】：叉头蛋白N1(Forkhead box protein N1,Fox N1)是翼状螺旋/叉头(Forkhead)转录因子家族成员,在胸腺遗传网络上占据重要位置。Fox N1基因是一个与胸腺发育及毛发生长相关的重要基因,它的缺失会导致严重的胸腺发育不健全,甚至是免疫缺陷。目前,针对民猪Fox N1基因序列的研究尚未出现报道。试验旨在对民猪Fox N1基因的功能进行初步探究。利用常规PCR技术对民猪Fox N1基因进行克隆,包括FoxN1基因组序列的克隆以及完整编码区序列的克隆。利用生物信息学手段对所获得Fox N1基因完整编码区序列进行分析,对民猪和大白猪的FoxN1基因编码区序列进行比对,进而对遗传变异位点进行分析。采用RT-PCR方法检测Fox N1基因在所采集的各类组织样品中的表达情况。以2月龄、4月龄、6月龄和8月龄的民猪为实验材料,采用定量PCR检测FoxN1在mRNA水平的转录情况,采用Western-blot检测FoxN1在蛋白水平的翻译情况。本实验的研究结果如下:(1)成功克隆了民猪FoxN1基因组序列14 730bp。包括8个外显子和7个内含子。外显子的位置从1到8分别是从1-123,518-976,3 732-3 842,5 512-5 642,7 800-7 896,11 390-11 597,11 746-12 237,14 411-14 730。(2)成功克隆了民猪FoxN1基因完整编码区序列,大小为1 941 bp,编码646个氨基酸,分子质量为68.64 k Da,理论等电点为5.81。Fox N1蛋白位于细胞核内,不存在信号肽,不是分泌性蛋白质,不存在跨膜区,在第269-347氨基酸处有1个叉头结构域,该蛋白在不同的物种间有高度的保守性。利用BLAST比对的方法获得了42个物种的FoxN1基因编码区序列,利用MEGA6.0软件构建了基于Fox N1基因序列的分子进化树,发现民猪与牛、水牛、绵羊、藏羚羊等偶蹄目动物聚为一类,亲缘关系较近其余物种也都符合物种进化规律,聚在不同的分支上。(3)成功构建了pEGFP-N1-FoxN1-a/b/c质粒,瞬时转染PK15细胞,用荧光倒置显微镜观察到Fox N1蛋白主要表达于细胞核中。(4)通过克隆发现了民猪Fox N1基因在胸腺组织的3种转录剪切变异体,符合可变剪切体的几种形式。与变异体1相比,变异体2在第124-387核苷酸位置处发生缺失,序列大小为1 677bp,变异体3在581-582核苷酸位置处发生GCA插入,序列大小为1 944bp。(5)将民猪与大白猪的Fox N1基因完整编码区序列进行比较,发现存在4个明显突变位点,其中3个是同义突变,1个是错义突变,并导致第108位的氨基酸发生了改变。(6)对民猪FoxN1基因在13个组织中进行表达检测,结果表明其仅在皮肤、胸腺和舌上有显著表达。(7)FoxN1基因在不同月龄的民猪胸腺组织进行荧光定量PCR操作,在4月龄的表达量显著提高。(8)Fox N1基因在不同月龄的民猪胸腺组织进行Western-blot操作,在4月龄的表达量显著提高。
【关键词】：民猪 FoxN1基因 基因克隆 序列分析 表达
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要10-12
• 英文摘要12-14
• 1 前言14-22
• 1.1 Fox家族简介14-17
• 1.1.1 Fox的染色体定位及基因组结构14-15
• 1.1.2 Fox蛋白的结构和转录调节机制15
• 1.1.3 Fox蛋白的功能及其与疾病的关系15-16
• 1.1.4 Fox家族的展望16-17
• 1.2 Fox N1基因的研究进展17-19
• 1.2.1 Fox N1基因的简介17
• 1.2.2 Fox N1的基因结构和蛋白特征17
• 1.2.3 Fox N1基因的生物学功能17-18
• 1.2.4 Fox N1基因的研究进展18-19
• 1.3 生物信息学分析的研究进展19-21
• 1.3.1 生物信息学的背景19
• 1.3.2 生物数据库介绍19-20
• 1.3.3 生物信息学数据分析工具20
• 1.3.4 生物信息学研究的主要内容20-21
• 1.4 实验目的和意义21-22
• 2 材料与方法22-33
• 2.1 材料22-24
• 2.1.1 实验动物22
• 2.1.2 细胞株22
• 2.1.3 实验试剂22
• 2.1.4 主要仪器设备22-23
• 2.1.5 缓冲液与主要试剂的配制23
• 2.1.6 主要生物学软件23
• 2.1.7 相关生物信息学网址23-24
• 2.2 方法24-33
• 2.2.1 模板的制备24
• 2.2.2 民猪Fox N1基因组序列的克隆24-26
• 2.2.3 民猪Fox N1基因完整编码区的克隆26-27
• 2.2.4 民猪与大白猪Fox N1基因编码区序列的比对27
• 2.2.5 民猪Fox N1蛋白序列的生物信息学分析27-28
• 2.2.6 pEGFP-N1-Fox N1重组质粒构建28-29
• 2.2.7 细胞的培养、转染、检测、亚细胞定位29
• 2.2.8 民猪Fox N1基因组织表达谱的构建29-30
• 2.2.9 Real-Time PCR检测民猪Fox N1基因30-31
• 2.2.10 Western Blot检测民猪Fox N1表达规律31-33
• 3 结果与分析33-50
• 3.1 民猪FoxN1基因组序列扩增33
• 3.1.1 民猪基因组DNA的提取33
• 3.1.2 民猪Fox N1基因组序列扩增33
• 3.2 民猪FoxN1基因CDS区全长扩增33-34
• 3.3 民猪FoxN1基因的生物信息学分析34-40
• 3.3.1 蛋白质氨基酸组成、分子量和等电点分析34
• 3.3.2 蛋白质疏水性分析34
• 3.3.3 蛋白质信号肽预测34-35
• 3.3.4 跨膜区预测35-36
• 3.3.5 亚细胞定位预测36
• 3.3.6 蛋白质功能结构域预测36
• 3.3.7 同源性比对和分子系统发生分析36-40
• 3.4 民猪FoxN1基因的转录剪切变异体的发现及鉴别40
• 3.5 民猪与大白猪FoxN1基因编码区序列的比对40-41
• 3.6 亚细胞定位41-44
• 3.6.1 pGM-T-Fox N1质粒和pEGFP-N1质粒双酶切41-42
• 3.6.2 构建pEGFP-N1-Fox N1重组质粒42-43
• 3.6.3 瞬时转染重组质粒pEGFP-N1-Fox N1-a/b/c基因的定位结果43-44
• 3.7 民猪FoxN1基因在各组织中的扩增结果44-45
• 3.8 Real-Time PCR鉴定Fox N1基因在民猪胸腺各阶段的表达45-48
• 3.8.1 标准曲线的建立45-47
• 3.8.2 Fox N1基因在胸腺组织的表达情况47-48
• 3.9 Western blot鉴定Fox N1蛋白在民猪胸腺各阶段的表达48-50
• 3.9.1 BSA标准曲线的建立48
• 3.9.2 Western blot检测Fox N1蛋白在民猪胸腺不同月龄的表达48-50
• 4 讨论50-53
• 4.1 民猪FoxN1基因的克隆与生物信息学分析50
• 4.2 民猪FoxN1基因的可变剪接体50-51
• 4.3 民猪FoxN1基因的亚细胞定位51
• 4.4 民猪和大白猪Fox N1基因的序列比对51
• 4.5 民猪FoxN1基因的表达特异性分析51-53
• 5 结论53-54
• 致谢54-55
• 参考文献55-60
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文60

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