水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用

发布时间：2017-08-26 08:06

  本文关键词：水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用

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【摘要】：近年来,受市场需求的刺激,水貂养殖业迅猛发展。山东也成为了我国水貂的养殖大省。但是,随着水貂养殖规模的不断扩大,一些疫病也成为了制约水貂养殖业发展的重要因素。水貂阿留申病(Aleutian Mink Disease,AD),作为毛皮动物三大疫病之一(阿留申病、病毒性肠炎、犬瘟热)(李艳伍等.,2009),会造成水貂的毛皮质量的下降,对养殖业造成巨大经济损失。但是,目前,还没有专门的药物或者疫苗来防治此病,只能通过检疫淘汰病貂达到对貂群的净化。因此,研究水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,ADV)在山东地区的分子生物学特点,建立一种特异性的检测方法具有重要意义。在2014-2015年间,本实验室对检测到的患水貂阿留申病的水貂脏器进行研磨,将研磨液接种到猫肾细胞(CRFK)中分离培养。当细胞出现稳定的病变后,提取细胞DNA进行PCR检测,结果呈现阿留申阳性。将扩增的序列进行测序,与参考序列ADV-G比对后,核苷酸同源性达到92.6%。但是,随着病毒传代次数的增加,细胞病变逐渐消失,PCR检测呈现阴性。说明该病毒不能在猫肾细胞中稳定传代。同时,我们对从山东省诸城某水貂养殖场采集的134份水貂实质器官进行检测,发现有37株呈现水貂阿留申病阳性,阳性率达到27.6%。对37株水貂阿留申病毒进行VP2基因的扩增并进行序列测定。用生物软件分析后发现,37株测序株间VP2基因核苷酸相似性为88%-99.8%,与GenBank中参考序列的相似性为88.0%-100%。并且,我们观察到:山东地区水貂阿留申病毒VP2基因存在大量的突变位点。将测序株与参考株经进化树分析后,分成5个分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)。VP2基因进化树显示89%的国内毒株处在进化树的第Ⅰ和第Ⅴ分支,而这两个分支不包含国外毒株。其中,有78.4%的毒株处在第Ⅰ分支。余下的11%的国内毒株则与其他国外毒株有较近的亲缘关系。这说明我国水貂阿留申病毒已经有别于国外毒株,形成了自己的独立进化支。由于大多数分离到的毒株处于第Ⅰ分支,我们暂且认为可能山东地区的毒株在向第Ⅰ分支进化的趋势。这对找出本地区流行的水貂阿留申病毒的标准毒株,以便进行对该病的检测提供科学依据。为了进一步研究分离到的37株病毒VP2基因的分子特征,用DNASTAR软件分别推导出各基因片段的氨基酸序列,并与参考毒株进行比较分析。结果发现:测序株间氨基酸的相似性为89.2%-99.7%,与参考序列间的相似性87.7%-100%。纵观VP2的整个氨基酸序列中,突变较多,有超过100多个氨基酸的突变。突变较集中的区域有三个,其中包括免疫反应区VP2:429-524。有14个突变位点只存在于中国毒株。其中,位点204:V-I、305:K-T、308:T-S、419:L-I、436:I-M的突变,突变毒株超过10个。419:L-I、436:N-D两个突变存在于VP2:428-446区域,而该区域可能影响水貂阿留申病毒的宿主范围的选择(McKenna et al.,1999)。对于其它几个频率较高的突变,我们目前还没有确切的研究来表明它突变的意义。其次,本实验室针对VP2序列的高免疫反应区(430-525)进行原核表达,并建立了间接ELISA检测方法。将扩增出的序列与pET-32a原核表达载体连接,在大肠杆菌BL21中进行表达。当诱导剂IPTG的浓度为1mmol/L,在37℃诱导4h的表达量最高。表达蛋白经Western blot检测后具有良好的反应原性。将纯化蛋白包被酶标板,通过优化条件,建立了间接ELISA检测方法。用建立好的方法对84份送检的血清样本进行检测,检出率为26.2%。
【关键词】：水貂 阿留申病毒 分离鉴定 VP2基因 分子流行病学调查 间接ELISA检测
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.92
【目录】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 前言13-14
• 1 综述14-25
• 1.1 ADV的生物学特性14-15
• 1.1.1 ADV的分类地位14
• 1.1.2 ADV的形态特征14
• 1.1.3 ADV的理化特性14-15
• 1.1.4 ADV的培养特性15
• 1.2 ADV的分子生物学研究15-18
• 1.2.1 ADV的基因组特点15-16
• 1.2.2 ADV基因的复制和转录16
• 1.2.3 ADV编码的蛋白16-18
• 1.3 水貂阿留申病的研究18-21
• 1.3.1 AD的流行病学18-19
• 1.3.2 AD的发病机理19-20
• 1.3.3 AD的临床症状20
• 1.3.4 AD的病理变化20-21
• 1.4 AD的诊断21-23
• 1.4.1 病原学诊断21
• 1.4.2 血清学诊断21-22
• 1.4.3 分子生物学诊断22-23
• 1.5 AD的综合防治23-24
• 1.6 本研究的目的及意义24-25
• 2 材料与方法25-42
• 2.1 材料25-27
• 2.1.1 病料25
• 2.1.2 主要试剂25
• 2.1.3 主要仪器25
• 2.1.4 质粒与菌种25-26
• 2.1.5 试剂的配制26-27
• 2.2 方法27-42
• 2.2.1 水貂阿留申病毒的分离鉴定27-30
• 2.2.2 山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究30-35
• 2.2.3 间接ELISA检测方法的建立35-42
• 3 结果42-54
• 3.1 水貂阿留申病毒的分离鉴定结果42-44
• 3.1.1 PCR初步检测结果42-43
• 3.1.2 ADV的分离结果43
• 3.1.3 ADV分离的PCR鉴定结果43-44
• 3.1.4 序列的核苷酸同源性比较44
• 3.2 山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究结果44-47
• 3.2.1 PCR扩增结果44-45
• 3.2.2 酶切鉴定结果45-46
• 3.2.3 同源性分析与系统发育分析结果46-47
• 3.3 间接ELISA检测方法的建立结果47-54
• 3.3.1 重组载体pMD18-T-VP2的PCR鉴定结果47
• 3.3.2 重组载体pMD18-T-VP2的酶切鉴定结果47-48
• 3.3.3 重组表达载体pET-32a-VP2的PCR鉴定结果48
• 3.3.4 重组表达载体pET-32a-VP2的酶切鉴定结果48-49
• 3.3.5 重组质粒pET-32a-VP2的序列测定结果49
• 3.3.6 表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果49
• 3.3.7 表达蛋白的Western blot检测结果49-50
• 3.3.8 纯化蛋白的SDS-PAGE电泳结果50
• 3.3.9 抗原包被浓度和一抗稀释度的确定50-51
• 3.3.10 抗原包被条件的确定51
• 3.3.11 封闭液的确定51-52
• 3.3.12 封闭液作用时间的确定52
• 3.3.13 二抗最佳稀释度的确定52
• 3.3.14 底物最佳作用时间的确定52-53
• 3.3.15 临界值的确定53
• 3.3.16 特异性检测结果53
• 3.3.17 敏感性检测结果53
• 3.3.18 重复性检测结果53
• 3.3.19 临床样本检测结果53-54
• 4 讨论54-59
• 4.1 水貂阿留申病毒的分离鉴定54-55
• 4.2 山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究55-57
• 4.3 间接ELISA检测方法的建立57-59
• 5 结论59-60
• 参考文献60-68
• 攻读学位期间发表论文情况68-69
• 致谢69

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本文编号：740563