猫泛白细胞减少症病毒反向遗传学操作系统的建立

发布时间：2017-08-26 14:24

  本文关键词：猫泛白细胞减少症病毒反向遗传学操作系统的建立

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【摘要】：猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV,FLPV),又称猫细小病毒。主要易感动物是猫,故而又称为猫瘟热病,也可感染猫以外的多种猫科动物。由于细小病毒颗粒体积极小,最初并没有学者报道。随着电镜及病毒分离技术广泛使用,科研者在传代细胞和肿瘤组织陆续分离到细小病毒。法国人Verge首次发现,1939年正式命名,1985年首次在我国自然感染病例中分离到一株猫细小病毒,从而证实猫细小病毒在我国流行。1986年国内文献首次报道云豹、非洲幼狮、华南虎均感染了FPV。由此证明:虎、豹、狮等多种珍稀野生动物已经严重受到猫泛白细胞减少症病毒的威胁。我国某实验动物基地2008年从猴传染性腹泻病料中分离到一株猫细小病毒的变异株(BJ-22株),其VP2氨基酸序列与FPV的同源性高达98.75%,与CPV的同源性为98.15%。可见,FPV宿主感染谱正在不断扩大,已由最初的猫科动物扩展至非人灵长类,对社会公共卫生安全构成巨大威胁。本文首先对FPV HH-1/86株细小病毒理化性质进行鉴定,并对其全基因组进行测序。在此基础上构建该株细小病毒感染性克隆pFPV,利用脂质体转染法将其导入F81细胞,成功拯救获得带有遗传标记的重组病毒r FPV。为揭示猫细小病毒高频率跨物种传播特征和分子机制提供反向遗传学操作平台;为猫细小病毒跨物种传播预警和有效防治提供科学依据。该株病毒电镜下可见直径20nm左右的立体对称细小病毒粒子。经实验证实:该病毒在连续50℃加热1h、pH3.0作用2h和乙醚作用2h,病毒TCID50升高不到一个对数,表明病毒对热、酸、乙醚具有一定的耐受性,pH在5.8~6.8 0.015M PBS均能凝集1%猪红细胞,其中pH 6.5血凝活性最佳。该病毒全基因组长5123nt,C+G的含量为36.35%。3’末端反向重复序列(Inverted Terminal Repeats,ITR)形成Y型结构,长126nt;5’末端ITR形成U型结构,长198nt。本实验利用overlap PCR方法,以病毒基因组片段M1、M2、M3为模板,克隆基因组中间大片段M1+M2+M3,经凝胶电泳鉴定正确。通过Infusion克隆技术将中间片段M1+M2+M3插入含3’和5’端质粒pE中。体外定点突变:将2981nt由A→G,产生一个新酶切位点Xho I,构建FPV全基因组感染性克隆pFPV。经酶切和序列测定证明pFPV正确,用脂质体转染方法,以Lip3000与质粒pFPV按7.5μL:3.5μg比例转染F81细胞。转染后72h,细胞出现明显拉网、脱落等细小病毒细胞病变,将rFPV0三冻三融后按5%同步接毒,第2代后rFPV接毒量降至1%同步接毒,连续传代至15代,用于病毒鉴定。通过CPE鉴定、免疫荧光、生长曲线、血凝试验、western blot试验,结果证明,rFPV与亲代毒(FPV HH-1/86)病毒学及生物学特性没有明显差异。本研究为探究猫细小病毒跨物种传播关键氨基酸位点、揭示猫细小病毒高频率跨物种传播分子机理,从而有效防治猫细小病毒跨物种传播奠定基础。
【关键词】：猫泛白细胞减少症病毒 感染性克隆 脂质体转染法 病毒拯救 病毒鉴定
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-23
• 1.1 细小病毒形态及理化特征12-13
• 1.2 细小病毒基因组组成及蛋白功能概述13-16
• 1.2.1 细小病毒基因组组成13-14
• 1.2.2 细小病毒非结构蛋白及其功能14-15
• 1.2.3 细小病毒结构蛋白及其功能15-16
• 1.3 细小病毒滚动式复制16-17
• 1.4 细小病毒受体转铁蛋白17
• 1.5 FPV、MEV和CPV的进化概述17-19
• 1.6 病毒反向遗传学研究概况19-22
• 1.6.1 反向遗传学原理19-20
• 1.6.2 反向遗传学应用20
• 1.6.3 细小病毒反向遗传系统构建20-22
• 1.7 研究内容及目的意义22-23
• 第二章 FPV HH-1/86株理化性质鉴定及全基因组测序23-33
• 2.1 材料与方法23-26
• 2.1.1 毒株23
• 2.1.2 实验仪器23
• 2.1.3 试剂23
• 2.1.4 细小病毒电镜观察23-24
• 2.1.5 病毒理化特性试验24
• 2.1.6 细小病毒最适pH范围试验24
• 2.1.7 细小病毒基因组DNA提取24
• 2.1.8 病毒中间片段扩增24-25
• 2.1.9 PCR产物末端加碱基A25-26
• 2.1.10 连接pMD19-T载体26
• 2.1.11 连接产物转化26
• 2.1.12 病毒末端ITR扩增及连接pMD19-T载体测序26
• 2.2 结果26-31
• 2.2.1 细小病毒形态学鉴定26-27
• 2.2.2 病毒理化性质试验结果27
• 2.2.3 病毒最适pH范围试验结果27-28
• 2.2.4 病毒基因组PCR扩增电泳结果28-29
• 2.2.5 NS1和VP2氨基酸序列进化分析29-30
• 2.2.6 HH-1/86株 3’末端Y和 5’末端U功能分析30-31
• 2.3 讨论31-33
• 第三章 FPV全长质粒pFPV构建33-39
• 3.1 材料与方法33-36
• 3.1.1 主要试剂33
• 3.1.2 主要仪器33
• 3.1.3 中间片段overlap PCR33-34
• 3.1.4 PCR产物胶回收34-35
• 3.1.5 定点突变35
• 3.1.6 Dpn I产物转化35
• 3.1.7 质粒小提35
• 3.1.8 In-fusionTM实验35-36
• 3.2 结果36-38
• 3.2.1 overlap PCR电泳结果36
• 3.2.2 遗传标记鉴定36-37
• 3.2.3 感染性克隆的构建与鉴定37-38
• 3.3 讨论38-39
• 第四章 rFPV病毒拯救与鉴定39-48
• 4.1 材料与方法39-42
• 4.1.1 试剂39
• 4.1.2 主要仪器39
• 4.1.3 F81细胞复苏与传代培养39
• 4.1.4 F81细胞瞬时转染实验39-40
• 4.1.5 rFPV病毒培养40
• 4.1.6 间接免疫荧光实验40
• 4.1.7 FPV多步生长曲线的绘制40
• 4.1.8 Western Blot实验40-41
• 4.1.9 遗传标签酶切鉴定41-42
• 4.1.10 血凝鉴定42
• 4.2 结果42-47
• 4.2.1 CPE鉴定42-43
• 4.2.2 遗传标记酶切鉴定43-44
• 4.2.3 间接免疫荧光鉴定44-45
• 4.2.4 拯救病毒rFPV增殖特性结果45-46
• 4.2.5 Western Blot检测rFPV46
• 4.2.6 血凝鉴定结果46-47
• 4.3 讨论47-48
• 第五章 全文结论48-49
• 5.1 结论48
• 5.2 展望48-49
• 参考文献49-54
• 致谢54-55
• 作者简介55-56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 薛向红;郑学星;盖微微;梁红茹;马金柱;李岭;王铁成;冯娜;黄耕;赵永坤;杨松涛;夏咸柱;;狂犬病病毒CVS-11株全序列测定及其感染性克隆的构建[J];微生物学报;2013年04期

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本文编号：741905