蓝氏贾第虫贾第素α-13及延伸因子EF-1α的原核表达及亚细胞定位

发布时间：2017-08-26 23:45

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【摘要】：蓝氏贾第虫是一种重要的人兽共患寄生性原虫,寄生于人和多种哺乳动物的小肠,常引起以腹泻、腹痛和消化不良等为主的贾第虫病。贾第虫滋养体具有高度发达的细胞骨架系统(微管、微丝和骨架蛋白),在入侵宿主过程中能够释放一些分泌性蛋白,两者均与其致病机理密切相关。本文以人兽共患的蓝氏贾第虫A型为研究对象,分别扩增贾第素α-13和延伸因子EF-1α的编码基因并进行原核表达,利用Ni-NTA Resin层析柱对表达产物进行纯化,分别制备多克隆抗体对贾第素α-13及EF-1α进行滋养体的亚细胞定位,以便为探索贾第素α-13及EF-1α的生物学功能奠定基础。1.贾第素α-13的原核表达及亚细胞定位。根据GenBank中贾第素α-13基因序列设计引物,以贾第虫DNA基因组为模板,扩增贾第素α-13基因。构建重组表达质粒pET-28a(+)-g-α13并转化BL21(DE3)感受态细胞。采用IPTG诱导和复合自动诱导培养基(ZYM-5052)对目的蛋白进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定并经Ni-NTA Resin层析柱纯化,纯化产物与免疫佐剂乳化后免疫昆明鼠制备多克隆抗体。通过Western blot筛选特异性抗血清,采用间接免疫荧光法对贾第素α-13进行亚细胞定位。结果显示,贾第素α-13基因全长为1038 bp,编码345个氨基酸,融合蛋白Mr约为40 kDa,主要以可溶性形式存在。试验获得了大量高纯度的融合蛋白。制备的多克隆抗体具有良好的抗原结合力及特异性,间接免疫荧光显示贾第素α-13主要位于滋养体的鞭毛和细胞膜。2.延伸因子EF-1α的原核表达及亚细胞定位。根据GenBank中EF-1α基因序列设计引物,以贾第虫DNA为模板,扩增EF-1α基因。构建重组表达质粒pET-28a(+)-EF-1α并转化BL21(DE3)感受态细胞。采用IPTG对目的蛋白进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,并采用Ni-NTA Resin层析柱纯化。经生物信息学分析后合成EF-1α抗原肽,与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,采用Protein A Resin亲和层析纯化抗体,通过Western blot验证抗体结合力,最后采用间接免疫荧光法对EF-1α进行亚细胞定位。结果显示,EF-1α基因全长为1329 bp,编码442个氨基酸,融合蛋白Mr约为50 kDa,试验获得了较纯净的融合蛋白;抗体AFL1192具有良好的抗原结合力与特异性,间接免疫荧光显示EF-1α主要定位于滋养体两细胞核周围的胞浆中。
【关键词】：蓝氏贾第虫 贾第素α-13 延伸因子EF-1α 原核表达 亚细胞定位
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩写词与英汉对照7-13
• 1 前言13-17
• 2 材料与方法17-48
• 2.1 材料17-27
• 2.1.1 样品17
• 2.1.2 实验动物17
• 2.1.3 菌种17
• 2.1.4 载体17
• 2.1.5 酶和试剂17-19
• 2.1.6 主要仪器19-20
• 2.1.7 常用溶液的配制20-26
• 2.1.8 引物26-27
• 2.2 方法27-48
• 2.2.1 贾第素 α-13 的原核表达及亚细胞定位27-43
• 2.2.1.1 贾第虫滋养体的培养及冻存27-28
• 2.2.1.2 贾第虫基因组DNA的提取28-29
• 2.2.1.3 贾第虫贾第素 α-13 基因的扩增29
• 2.2.1.4 PCR产物检测29-30
• 2.2.1.5 PCR扩增产物的回收与纯化30
• 2.2.1.6 p MD-18T-α-13 克隆载体的构建30-31
• 2.2.1.7 克隆载体的转化31
• 2.2.1.8 p MD18-α-13 克隆载体的提取31-32
• 2.2.1.9 贾第素 α-13 的生物信息学分析32-33
• 2.2.1.10 带粘性末端目的基因片段的制备33-34
• 2.2.1.11 表达载体p ET-28a(+)的线性化34
• 2.2.1.12 重组表达载体p ET-28a( + )-g-α13 的连接34-35
• 2.2.1.13 重组表达载体的转化35
• 2.2.1.14 重组质粒的双酶切鉴定35-36
• 2.2.1.15 重组质粒的诱导表达36-37
• 2.2.1.16 贾第素 α-13 融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳37-38
• 2.2.1.17 融合蛋白表达部位的检测38
• 2.2.1.18 融合蛋白的纯化38-39
• 2.2.1.19 重组蛋白Western blot检测39
• 2.2.1.20 融合蛋白的蛋白浓度测定39-40
• 2.2.1.21 实验动物免疫40-41
• 2.2.1.22 血清分离41
• 2.2.1.23 间接ELISA法检测抗血清效价41
• 2.2.1.24 贾第虫滋养体虫体蛋白的提取41-42
• 2.2.1.25 Western blot检测抗血清的结合力和特异性42
• 2.2.1.26 贾第素 α-13 的免疫荧光显微镜观察42-43
• 2.2.2 贾第虫EF-1α 蛋白的原核表达及亚细胞定位43-48
• 2.2.2.1 贾第虫虫株的培养及冻存43
• 2.2.2.2 贾第虫基因组DNA的提取43
• 2.2.2.3 贾第虫EF-1α 基因的扩增43-44
• 2.2.2.4 PCR产物检测44
• 2.2.2.5 PCR扩增产物的回收与纯化44
• 2.2.2.6 p MD-18T-EF-1α 克隆载体的构建44
• 2.2.2.7 克隆载体的转化44
• 2.2.2.8 p MD18-EF-1α 克隆载体的提取44
• 2.2.2.9 贾第素EF-1α 的生物信息学分析44
• 2.2.2.10 带粘性末端目的基因片段的制备44
• 2.2.2.11 表达载体p ET-28a(+)的线性化44
• 2.2.2.12 重组表达载体p ET-28a( + )-EF-1α 的连接44
• 2.2.2.13 重组表达载体的转化44
• 2.2.2.14 重组质粒的双酶切鉴定44
• 2.2.2.15 重组质粒的诱导表达44-45
• 2.2.2.16 延伸因子EF-1α 融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳45
• 2.2.2.17 融合蛋白表达部位的检测45
• 2.2.2.18 融合蛋白的纯化45
• 2.2.2.19 重组蛋白Western blot检测45-46
• 2.2.2.20 融合蛋白的蛋白浓度测定46
• 2.2.2.21 延伸因子EF-1α 抗原肽的合成及偶联46
• 2.2.2.22 实验动物免疫46-47
• 2.2.2.23 血清分离47
• 2.2.2.24 多克隆抗体的纯化47
• 2.2.2.25 间接ELISA法检测抗血清效价47-48
• 2.2.2.26 Western blot检测抗血清的结合力和特异性48
• 2.2.2.27 滋养体EF-1α 的免疫荧光显微镜观察48
• 3 结果48-64
• 3.1 贾第素 α-13 的原核表达及亚细胞定位48-56
• 3.1.1 贾第素 α-13 基因的扩增与p MD18-T-α-13 克隆载体的构建48-49
• 3.1.2 重组质粒双酶切鉴定49
• 3.1.3 贾第素 α-13 的生物信息学分析49-51
• 3.1.3.1 贾第素 α-13 的信号肽预测49
• 3.1.3.2 贾第素 α-13 的跨膜区分析49
• 3.1.3.3 贾第素 α-13 的蛋白疏水性分析49-50
• 3.1.3.4 贾第素 α-13 的磷酸化位点分析50
• 3.1.3.5 贾第素 α-13 的二级结构预测50
• 3.1.3.6 贾第素 α-13 的三级结构预测50-51
• 3.1.4 贾第素 α-13 融合蛋白表达条件的优化51-53
• 3.1.4.1 常规IPTG的诱导表达及条件优化51-52
• 3.1.4.2 复合自动诱导培养基ZYM-5052 的诱导表达52-53
• 3.1.5 重组蛋白表达部位的鉴定53
• 3.1.6 贾第素 α-13 融合蛋白的分离与纯化53-54
• 3.1.7 抗血清效价测定54
• 3.1.8 贾第素 α-13 抗血清的结合力和特异性验证54-55
• 3.1.9 贾第虫滋养体 α-13 的免疫荧光定位55-56
• 3.2 延伸因子EF-1α 的原核表达及亚细胞定位56-64
• 3.2.1 贾第素 α-13 基因的扩增与p MD18-T-EF-1α 克隆载体的构建56
• 3.2.2 重组质粒的双酶切鉴定56-57
• 3.2.3 延伸因子EF-1α 的生物信息学分析57-59
• 3.2.3.1 延伸因子EF-1α 跨膜区分析57
• 3.2.3.2 延伸因子EF-1α 蛋白疏水性分析57
• 3.2.3.3 延伸因子EF-1α 的磷酸化位点分析57
• 3.2.3.4 贾第虫延伸因子EF-1α 蛋白二级结构预测57
• 3.2.3.5 贾第虫延伸因子EF-1α 蛋白三级结构预测57-58
• 3.2.3.6 贾第虫延伸因子EF-1α 的抗原表位分析58-59
• 3.2.4 贾第虫EF-1α 蛋白的诱导表达与鉴定59-61
• 3.2.5 贾第虫EF-1α 融合蛋白的纯化及浓度测定61
• 3.2.6 贾第虫EF-1α 蛋白特异性抗血清效价测定61
• 3.2.7 贾第虫EF-1α 蛋白特异性抗血清的SDS-PAGE分析61-62
• 3.2.8 EF-1α 抗血清的结合力和特异性验证62-63
• 3.2.9 贾第虫滋养体EF-1α 的免疫荧光定位63-64
• 4 讨论64-69
• 4.1 贾第素 α-13 的原核表达及亚细胞定位64-66
• 4.2 延伸因子EF-1α 的原核表达及亚细胞定位66-69
• 全文总结69-70
• 致谢70-71
• 参考文献71-76
• 附录A 贾第素α-13 及延伸因子EF-1α 扩增序列76-77
• 附录B pMD18-T载体77-78
• 附录C pET-28a(+)载体78-79
• 附录D 攻读硕士学位期间论文发表、学术会议及获奖情况79-80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：743320