MEF2C低表达对成肌细胞C2C12肌纤维组成的影响及分子作用机制的初步探讨

发布时间：2017-08-30 07:37

  本文关键词：MEF2C低表达对成肌细胞C2C12肌纤维组成的影响及分子作用机制的初步探讨

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【摘要】：目的通过建立MEF2C基因低表达的小鼠成肌细胞C2C12细胞株,利用实时定量PCR和Western blot技术分析MEF2C基因低表达后肌纤维和四个信号通路关键分子的表达情况,为进一步阐明MEF2C基因表达对肌纤维组成及相关信号通路影响的作用机制奠定基础。方法本研究采用RNAi技术,设计并合成3条针对猪MEF2C基因的RNA干扰序列,构建RNA干扰载体(shRNA),瞬时转染小鼠C2C12细胞,用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中MEF2C mRNA和蛋白的表达情况,选择高效特异shRNA序列;将干扰效率最佳的shRNA重组载体稳定转染至C2C12细胞中,获得3个MEF2C低表达混合细胞克隆株;采用实时定量PCR及Western blot技术检测低表达细胞株中MEF2C、CFL2、肌纤维组成成分(MLC、α-actin、MyHC slow、MyHC 2a、MyHC 2x和MyHC 2b)和信号通路关键分子(CaM、p38、AMPKα2、RhoA和skMLCK)的mRNA和蛋白表达水平,并进行统计学分析。结果1、成功构建针对猪MEF2C基因3个不同的干扰重组载体(shRNA)。shRNA瞬时转染至C2C12细胞后,MEF2C mRNA抑制率分别为67.09%±5.68%、59.70%±5.21%、68.80%±5.78%;MEF2C蛋白抑制率分别为19.33%±1.62%、17.58%±2.80%和43.81%±0.20%,因此第三条shRNA干扰MEF2C表达效果最好。2、实时定量PCR检测结果表明:与空白对照组相比,肌纤维成分中α-actin、MyHC slow、MyHC 2x、MyHC 2b显著或极显著提高(p0.05或p0.01),MLC、MyHC 2a极显著降低(p0.01);信号通路关键分子中CaM、p38、AMPKα2、RhoA显著或极显著降低(p0.05或p0.01),各组的skMLCK表达均不显著(p0.05);CFL2各组呈显著或极显著降低(p0.05或p0.01)。3、Western blot检测结果表明:与空白对照组相比,肌纤维成分中MLC、MyHC slow、MyHC 2a极显著降低(p0.01),而α-actin、MyHC 2x、MyHC 2b显著或极显著升高(p0.05或p0.01);信号通路关键分子中,p38显著升高(p0.05),其他四种成分(CaM、AMPKα2、RhoA、skMLCK)差异不显著(p0.05);CFL2显著或极显著升高(p0.05或p0.01)。4、建立了MEF2C与p38、CFL2和MyHC 2b相关关系的数学模型。统计分析表明,本实验所涉及基因的mRNA和蛋白质表达并不一致,说明由mRNA至蛋白质的翻译过程是C2C12细胞株基因表达的关键过程。5、结果表明,MEF2C mRNA与其蛋白呈极显著正相关(p0.01),相关系数为0.985,与CFL2蛋白呈极显著负相关(p0.01),相关系数为0.962;AMPKα2、CaM和p38 mRNA表达与MEF2C的蛋白表达呈显著或极显著正相关(p0.05或p0.01);其余各基因的mRNA与蛋白之间同样存在显著或极显著相关关系。结论C2C12细胞中MEF2C低表达使肌纤维成分MLC和MyHC 2a的表达量降低,而α-actin、MyHC 2b和MyHC 2x升高,说明MEF2C表达量影响肌纤维组成成分;MEF2C的低表达对肌纤维的影响机制可能涉及AMPK、CaM、MAPK和Rho四个信号通路。
【关键词】：MEF2C 低表达 肌纤维 信号通路
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 中文论著摘要4-6
• 英文论著摘要6-9
• 英文缩略语表9-11
• 前言11-12
• 实验材料与方法12-24
• 实验结果24-48
• 讨论48-54
• 结论54-55
• 本研究创新性的自我评价55-56
• 参考文献56-60
• 附录60-76
• 一、文献综述 MEF2C基因的研究进展60-72
• 参考文献67-72
• 二、在学期间科研成绩72-73
• 三、致谢73-75
• 四、个人简介75-76

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本文编号：758050