在烟草中表达猪轮状病毒VP7蛋白的研究

发布时间：2017-08-30 20:11

  本文关键词：在烟草中表达猪轮状病毒VP7蛋白的研究

  更多相关文章： 猪轮状病毒 VP7基因 植物疫苗 瞬时表达 稳定的遗传转化

【摘要】：近年来,植物疫苗的开发利用已经成为研究热点,因其具有安全、有效、成本低廉的优势,逐步得到科学界的认同。猪轮状病毒(PRV)是引起猪病毒性腹泻的主要病原微生物之一,是目前危害我国养猪业的一种主要病毒。VP7蛋白是轮状病毒(RV)粒子表面的外壳蛋白,也是RV主要的中和抗原,可以引起机体产生中和抗体,起到免疫保护作用。VP4和VP6蛋白分别是RV的外壳蛋白和内壳蛋白,都是重要的保护性抗原,在预防RV感染时,可与VP7一同刺激机体产生免疫效应。本研究通过构建高效植物表达载体,建立在烟草中表达VP7、VP4和VP6蛋白的遗传转化体系,为开发植物源PRV疫苗奠定基础。试验主要取得如下结果:(1)根据PRV VP7的氨基酸序列,选取能产生中和反应的51-312位氨基酸,用烟草偏爱密码子进行优化人工合成基因序列。在目的基因上游添加Ω序列以增强翻译,下游添加M细胞靶向肽-Col序列增强免疫效应,并添加内质网滞留信号ER序列定向表达蛋白,融合6个His标签用于蛋白的分离纯化。(2)成功构建了pBI121-VP7植物表达载体,通过冻融法转入农杆菌EHA105菌株中。利用农杆菌介导的注射侵染法将VP7基因转入本氏烟草中,经RT-PCR检测、SDS-PAGE及用His-Tag抗体进行Western Blotting分析,初步检测到VP7蛋白的表达。(3)用农杆菌EHA105介导的叶盘法将VP7基因转入普通烟草,经共培养、筛选、分化及生根过程最终得到2株转基因幼苗,通过烟草叶片直接PCR的方法进行鉴定,但未检测到目标条带,还需进一步验证VP7基因是否稳定转化。(4)设计并优化合成了PRV的VP4与VP7融合基因VP4-7以及VP6基因,成功构建了pBI121-VP4-7、pBI121-VP6植物表达载体,为后续在烟草中表达VP4-VP7融合蛋白、VP6蛋白及研发二价或二联植物疫苗奠定基础。
【关键词】：猪轮状病毒 VP7基因 植物疫苗 瞬时表达 稳定的遗传转化
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.797;Q943.2
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 文献综述10-18
• 1.1 猪轮状病毒PRV研究进展10-11
• 1.1.1 猪轮状病毒PRV概述10
• 1.1.2 PRV的三种主要抗原10-11
• 1.2 植物生物反应器的研究11-14
• 1.2.1 植物生物反应器特点11
• 1.2.2 植物转基因技术方法-农杆菌介导的植物转化11-13
• 1.2.3 植物生物反应器国内外研究现状13-14
• 1.3 RV转基因植物疫苗的研究14-15
• 1.4 植物疫苗研究问题分析15-16
• 1.5 免疫佐剂增强免疫原性和保护作用16
• 1.6 本研究的目的与意义16-17
• 1.7 试验技术路线17-18
• 第二章 猪轮状病毒VP7基因在烟草中的瞬时表达18-36
• 2.1 材料18-19
• 2.1.1 试验材料18
• 2.1.2 试验仪器18
• 2.1.3 主要试剂及配方18-19
• 2.2 试验方法19-28
• 2.2.1 VP7基因的设计及合成19-20
• 2.2.2 VP7基因植物表达载体的构建20-22
• 2.2.3 pBI121-VP7质粒转化农杆菌22-23
• 2.2.4 烟草的培养与瞬时转化23-24
• 2.2.5 转基因烟草转录水平的检测24-26
• 2.2.6 烟草总可溶性蛋白的提取26
• 2.2.7 SDS-PAGE、Western Blotting分析26-28
• 2.3 结果与分析28-34
• 2.3.1 VP7基因的优化合成28-29
• 2.3.2 VP7基因植物表达载体的构建29-31
• 2.3.3 pBI121-VP7重组质粒转化农杆菌的鉴定31-32
• 2.3.4 烟草的培养与瞬时转化32
• 2.3.5 转基因烟草转录水平的检测32-33
• 2.3.6 烟草蛋白粗提液的SDS-PAGE分析33-34
• 2.3.7 烟草粗提液的Western Blotting分析34
• 2.4 讨论34-35
• 2.5 小结35-36
• 第三章 猪轮状病毒VP7基因在烟草中的稳定转化36-41
• 3.1 试验材料36-37
• 3.1.1 植物材料、目的基因和菌种36
• 3.1.2 主要试验仪器和试剂36-37
• 3.2 试验方法37-38
• 3.2.1 农杆菌叶盘法转化烟草37
• 3.2.2 转基因烟草的初步鉴定37-38
• 3.3 结果与分析38-39
• 3.3.1 农杆菌叶盘法转化烟草38-39
• 3.3.2 转基因烟草的初步鉴定39
• 3.4 讨论39-40
• 3.5 小结40-41
• 第四章 VP4-7 与VP6基因植物表达载体的构建41-49
• 4.1 材料41
• 4.1.1 目的基因、菌种和载体41
• 4.1.2 主要试验仪器和试剂41
• 4.2 试验方法41-43
• 4.2.1 VP4-7、VP6基因的设计41-42
• 4.2.2 VP4-7、VP6基因植物表达载体的构建42-43
• 4.3 结果与分析43-48
• 4.3.1 VP4-7 基因的合成43-44
• 4.3.2 VP6基因的合成44-45
• 4.3.3 VP4-7、VP6基因植物表达载体的构建45-48
• 4.4 小结48-49
• 第五章 结论与展望49-50
• 5.1 结论49
• 5.2 创新点49
• 5.3 展望49-50
• 参考文献50-54
• 附录54-56
• 致谢56-57
• 作者简介57

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本文编号：761224