内蒙古中部地区羊源肠球菌临床株耐药性与毒力基因的检测

发布时间：2017-08-31 09:05

  本文关键词：内蒙古中部地区羊源肠球菌临床株耐药性与毒力基因的检测

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【摘要】：肠球菌是人和动物肠道内的正常菌群,过去被认为不会引发致病,但在近年来的研究中发现肠球菌可使人和动物致病,且肠球菌属感染已成为医院内感染疾病的第三位。自2013年7月至2014年11月,本实验从内蒙古中部地区羊场发生以神经症状为主要特征的脑组织多次分离到球菌,经过进一步鉴定后确认该分离菌株为肠球菌。由于屎肠球菌的分离比例较高,为进一步在临床上对此病原菌进行快速诊断,本研究开展了肠球菌与屎肠球菌的双重PCR试验,建立了双重PCR的试验条件和方法。试验将内蒙古中部地区分离到的羊源肠球菌菌株,结合本地区常用的抗生素药物,包括氟苯尼考、氧氟沙星、红霉素、恩诺沙星、万古霉素、土霉素、利福平、氨苄西林、链霉素,庆大霉素10种药物,利用微量肉汤稀释法,观察确定临床分离菌株的耐药性并测定其最小抑菌浓度(MIC值)。并用PCR方法对临床分离菌株的耐药基因进行检测,PCR试验结果表明：内蒙古中部地区羊源肠球菌具有氨基糖苷类耐药基因、红霉素耐药基因与四环素耐药基因。药物敏感性检测表明,临床分离菌株对土霉素、利福平、氨苄西林表现出明显的耐药性。对恩诺沙星、万古霉素、氧氟沙星较为敏感。有相关研究表明肠球菌属的耐药性多与其毒力基因相关,因此本试验检测了分离菌株的毒力基因,同时本研究为初步探索屎肠球菌心内膜炎抗原基因(EfaA)调控的蛋白功能,对屎肠球菌的毒力基因EfaA(心内膜炎抗原)进行了原核表达。试验结果表明：临床分离菌株检测到了cyl、Ace、GelE、EfaA、 AS、Esp毒力基因。经Western-blot方法检测,本试验成功表达出EfaA毒力基因。
【关键词】：羊肠球菌 双重PCR 耐药性 毒力基因 EfaA原核表达
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.26
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 缩略语表10-11
• 1 引言11-16
• 1.1 肠球菌属的生物特性11
• 1.2 肠球菌的分型11
• 1.3 肠球菌的致病性研究11-12
• 1.4 肠球菌的毒力基因12-13
• 1.4.1 细胞溶解素(cyl)12
• 1.4.2 表面蛋白(Esp)12
• 1.4.3 聚类物质(AS)12-13
• 1.4.4 蛋白明胶酶E(GelE)13
• 1.4.5 胶原蛋白粘附素(Ace)13
• 1.4.6 心内膜炎基因抗原(EfaA)13
• 1.5 肠球菌的耐药性13-14
• 1.6 肠球菌对万古霉素耐药性研究14
• 1.7 肠球菌耐药性与毒力基因的相关性研究14-16
• 2 肠球菌的分离、鉴定与同源性分析16-24
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 病料的来源16
• 2.1.2 主要仪器与设备16
• 2.1.3 生物学试剂16-17
• 2.1.4 试验动物17
• 2.2 试验方法17-20
• 2.2.1 试验方法设计方案17
• 2.2.2 菌株的培养与纯化17
• 2.2.3 分离菌株的鉴定17-20
• 2.2.4 临床分离菌株对小白鼠的致病性试验20
• 2.3 结果与分析20-23
• 2.3.1 菌株菌落特征及革兰氏染色结果20
• 2.3.2 生化试验结果20-21
• 2.3.3 16s-rRNA PCR试验测序鉴定结果21-23
• 2.3.4 动物试验结果23
• 2.4 讨论23-24
• 3 羊源肠球菌属与屎肠球菌双重PCR方法的建立24-31
• 3.1 材料24
• 3.1.1 试验菌株24
• 3.1.2 主要仪器及试剂24
• 3.2 方法24-26
• 3.2.1 引物设计24
• 3.2.2 细菌基因组DNA的提取24
• 3.2.3 双重PCR扩增24-25
• 3.2.4 双重PCR特异性试验25
• 3.2.5 双重PCR的敏感性试验25
• 3.2.6 双重PCR方法的验证25-26
• 3.3 结果与分析26-29
• 3.3.1 单对引物特异性验证及双重PCR反应结果26
• 3.3.2 双重PCR特异性试验结果26-27
• 3.3.3 双重PCR反应敏感性试验结果27-28
• 3.3.4 模拟感染样品的特异性试验结果28-29
• 3.4 讨论29-31
• 4 临床分离菌株耐药性及耐药基因的检测31-37
• 4.1 材料31-32
• 4.1.1 试验菌株31
• 4.1.2 主要试剂31
• 4.1.3 试验所用药物31-32
• 4.2 方法32-34
• 4.2.1 试验所用药物的配制方法32-33
• 4.2.2 细菌培养33
• 4.2.3 细菌的耐药性检测方法33
• 4.2.4 细菌总DNA的组提取33-34
• 4.2.5 耐药基因检测34
• 4.3 结果及分析34-36
• 4.3.1 细菌耐药性检测结果34
• 4.3.2 耐药基因试验结果34-36
• 4.4 讨论36-37
• 5 羊源屎肠球菌毒力基因的检测及心内膜炎基因EFAA基因原核表达37-51
• 5.1 材料37
• 5.1.1 试验所用表达载体37
• 5.1.2 试验所用试剂37
• 5.2 方法37-43
• 5.2.1 主要溶液的配置方法38
• 5.2.2 提取临床分离菌株的总DNA38
• 5.2.3 临床分离菌株毒力基因的检测38-39
• 5.2.4 EfaA毒力基因的纯化39
• 5.2.5 EfaA毒力基因克隆与检测39-40
• 5.2.6 EfaA毒力基因克隆质粒提取40
• 5.2.7 空质粒的制备40
• 5.2.8 PCR方法鉴定提取质粒的正确表达方向40
• 5.2.9 EfaA毒力基因表达的检测双酶切试验40-41
• 5.2.10 IPTG诱导试验41-42
• 5.2.11 Western blot检测42-43
• 5.2.12 抗体反应和显色反应43
• 5.3 试验结果43-49
• 5.3.1 羊源屎肠球菌毒力基因的检测结果43
• 5.3.2 胶原蛋白黏附素(Ace)毒力基因检测结果43
• 5.3.3 细胞溶解素(cyl)检测结果43-44
• 5.3.4 蛋白明胶酶E(GelE)检测结果44
• 5.3.5 心内膜炎抗原基因(EfaA)检测结果44-45
• 5.3.6 聚集物质基因(AS)检测结果45-46
• 5.3.7 表面蛋白基因(Esp)检测结果46
• 5.3.8 ATCC 51299毒力基因检测结果46-47
• 5.3.9 EfaA测序结果47
• 5.3.10 双酶切试验结果47-48
• 5.3.11 IPTG诱导试验结果48
• 5.3.12 Western Blot检测结果48-49
• 5.4 讨论49-51
• 6 全文结论51-52
• 致谢52-53
• 参考文献53-58
• 作者简介58

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