PEDV部分N基因的原核表达和间接ELISA方法的建立

发布时间：2017-08-31 09:26

  本文关键词：PEDV部分N基因的原核表达和间接ELISA方法的建立

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【摘要】：猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水和高死亡率。该病毒首次出现在1977年的英国和1978年的比利时。在过去的30年里,PEDV感染已经在欧洲和亚洲的养殖业产生了巨大的经济损失。尤其在2013-2014年,PEDV在美国大面积爆发,并传播到美国北方的其他国家包括加拿大和墨西哥等。在美国,从2013年开始,仅一年的时间已经造成总猪量10%以上的经济损失,总计约七百万仔猪死亡。为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)部分N蛋白的原核表达产物是否具有抗原性,并为建立PEDV的间接ELISA方法奠定基础。本试验应用RT-PCR技术扩增N基因的部分核酸序列,经克隆后将目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)中,成功构建了重组质粒pET-30a-PEDV-N-450,重组菌于37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析并进行Western blotting鉴定。结果表明,构建的原核表达重组质粒测序正确,且该蛋白与抗血清(PEDV高免血清)具有良好的反应活性。本试验已成功构建的PEDV部分N蛋白基因表达载体,该研究为后续猪流行性腹泻病毒感染的血清学诊断方法的建立提供依据。为了建立猪流行性腹泻病毒抗体检测的间接ELISA方法,本研究以纯化的原核表达的猪流行性腹泻病毒部分N基因的重组蛋白作为包被抗原,建立了猪流行性腹泻病毒抗体检测的间接ELISA方法,将该方法命名为rnPED-ELISA。该抗原不与其它常见的七种猪病的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%;rnPED-ELISA相对于SN试验的敏感性为93.33%、特异性为90.00%;rnTGE-ELISA与TSZ公司的全病毒抗体检测试剂盒的符合率达91.67%。采用rnPED-ELISA方法检测200份临床样品,PEDV抗体阳性检出率为83.5%。本试验建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可以为免疫猪群抗体监测和PED流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。
【关键词】：猪流行性腹泻病毒 N基因片段 原核表达 间接ELISA
【学位授予单位】：天津农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要11-12
• Abstract12-13
• 第一章 引言13-26
• 1.1 病原学13-16
• 1.1.1 分类13-14
• 1.1.2 结构和基因组14-16
• 1.1.3 生物学和物理化学性质16
• 1.1.4 病毒分离培养16
• 1.2 流行病学16-18
• 1.2.1 世界流行情况16-17
• 1.2.2 美国流行情况17-18
• 1.2.3 传播18
• 1.3 发病机制18-20
• 1.3.1 组织嗜性18-19
• 1.3.2 病毒肠道复制19
• 1.3.3 病理生理学19
• 1.3.4 抵抗PED的年龄因素19
• 1.3.5 急性病毒血症19-20
• 1.3.6 免疫应答20
• 1.3.7 病毒衰减20
• 1.4 流行性PED与地方性PED20-21
• 1.4.1 流行性PED20-21
• 1.4.2 地方性PED和细菌病毒共感染21
• 1.5 病变21-22
• 1.5.1 眼观病变21-22
• 1.5.2 组织学病变22
• 1.6 免疫预防22-23
• 1.6.1 流行病PED22
• 1.6.2 地方性PED22-23
• 1.7 诊断23
• 1.8 疫苗23-24
• 1.9 治疗24-25
• 1.10 总结25
• 1.11 本研究的特色25-26
• 第二章 PEDV部分N基因的原核表达及表达产物的反应原性分析26-50
• 2.1 试验材料26-29
• 2.1.1 病毒26
• 2.1.2 菌株26
• 2.1.3 载体26
• 2.1.4 RNA提取及PCR主要试剂26
• 2.1.5 工具酶26-27
• 2.1.6 蛋白质分子量标准27
• 2.1.7 试剂盒27
• 2.1.8 蛋白印迹转移膜27
• 2.1.9 溶液27-28
• 2.1.10 主要仪器28-29
• 2.2 试验方法29-42
• 2.2.1 PEDV N-450基因合成29-32
• 2.2.2 构建克隆载体PMDTM18-T-N450DH5α32-36
• 2.2.3 表达载体构建36-39
• 2.2.4 表达载体在大肠杆菌中诱导表达39-41
• 2.2.5 蛋白纯化工艺研究41-42
• 2.2.6 Western blotting分析42
• 2.3 试验结果42-48
• 2.3.1 N-450基因PCR42
• 2.3.2 克隆载体的构建42-44
• 2.3.3 表达载体的构建44-45
• 2.3.4 重组表达载体的诱导表达45-46
• 2.3.5 重组表达载体的可溶性鉴定46-47
• 2.3.6 表达蛋白的纯化47-48
• 2.3.7 Western blotting检测48
• 2.4 讨论48-50
• 2.4.1 目的基因的选择48-49
• 2.4.2 感受态细胞的选择49
• 2.4.3 诱导条件优化49
• 2.4.4 染料选择49-50
• 第三章 PEDV流行株部分N基因重组蛋白的间接ELISA方法建立50-60
• 3.1 材料50
• 3.2 方法50-54
• 3.2.1 测定蛋白浓度50-51
• 3.2.2 洗脱液透析浓缩51
• 3.2.3 间接ELISA方法的建立51-53
• 3.2.4 rnPED-ELISA性能评价53-54
• 3.3 结果54-57
• 3.3.1 蛋白浓度测定结果54
• 3.3.2 重组N蛋白的定量分析54
• 3.3.3 rnPED-ELISA试验条件摸索54-56
• 3.3.4 SN试验相关性分析56
• 3.3.5 与商品化试剂盒比较56-57
• 3.3.6 流行病学调查57
• 3.4 讨论57-60
• 3.4.1 ELISA工作条件的确定58
• 3.4.2 抗原的纯度对ELISA的影响58
• 3.4.3 临床检测结果58-60
• 第四章 结论60-61
• 参考文献61-70
• 附录70-71
• 致谢71-72
• 攻读学位期间发表论文的目录72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 张博;李守军;吕茂杰;杨保收;;猪流行性腹泻病毒部分N基因的原核表达及表达产物反应原性分析[J];中国畜牧兽医;2016年03期

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本文编号：764780