亮氨酸、组氨酸、赖氨酸和蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响及调控机理研究

发布时间：2017-08-31 16:30

  本文关键词：亮氨酸、组氨酸、赖氨酸和蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响及调控机理研究

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【摘要】：乳蛋白是乳的重要的营养组成成分,必需氨基酸(essential amino acid,EAA)不仅可以作为乳蛋白合成的前体物之一,还可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路中的蛋白调节乳蛋白合成,提高乳含量和品质。本研究以永生化奶牛乳腺上皮细胞(immortalized bovine mammary epithelial cell line,CMEC-H)为模型,首先分别单一添加亮氨酸(Leucine,Leu)和组氨酸(Histidine,His)从细胞增殖水平,mRNA转录水平和翻译水平探究这两种EAA通过mTOR信号通路调控酪蛋白(casein)合成的分子机理。在此基础上探讨了组氨酸(Histidine,His)、赖氨酸(Lysine,Lys),亮氨酸(Leucine,Leu)和蛋氨酸(Methionine,Met)的最佳配比,且阐明在此最佳配比模式下研究这四种EAA通过mTOR信号通路调控β-casein合成的分子机理。主要研究结果如下:试验一:本研究以体外培养的CMEC-H细胞为模型,研究单一添加Leu对casein的合成及相关信号通路的影响。以厄尔平衡溶液(EBSS)代替培养基,并设其为阴性对照,在此溶液基础上单一添加不同浓度的Leu,利用噻唑蓝比色法(MTT)法探讨添加不同浓度梯度的Leu水平以及培养时间(12 h和24 h)对CMEC-H细胞增殖的影响;同时运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)检测casein和mTOR信号路径元件因子的表达。MTT结果表明:与阴性对照组相比,添加0.15~5.40 mmol/L Leu时,CMEC-H细胞数量增加,且添加不同时间(12 h和24 h)CMEC-H细胞增殖趋势一致;qRT-PCR的结果表明:与阴性对照组相比,当添加0.45~10.8 mmol/L Leu 6 h时,αs1-casein(CSN1S1)、αS2-casein(CSN1S2)和κ-casein(CSN3)基因表达均显著上调(P0.05)。当Leu浓度为1.35mmol/L时,mTOR信号通路相关基因mTOR、m TOR调控蛋白(raptor)、mTOR复合物1中的绑定蛋白(GβL)、信号下游因子真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)和真核细胞翻译延伸因子2(eEF2)基因表达量最高。而核糖体S6蛋白激酶(S6K1)基因的表达量随着Leu浓度的增加而减少。WB的结果表明:与阴性对照相比,casein和P-mTOR(Ser2481)、P-raptor(Ser792)、P-eIF4E(Ser209)、P-eEF2(Thr56)随着Leu浓度的增加(0.45 to 10.8 mmol/L)而增加(P0.01),而Leu的浓度在1.35到10.8 mmol/L,P-S6K1(Thr389)随Leu浓度的增加而增加;当Leu浓度为10.8mmol/l时,p-4ebp1(thr37)和gβl表达量会被抑制。当leu浓度为5.4~10.8mmol/l时,p-rps6(ser235/236)随leu浓度的增加而减少。线性回归模型分析结果显示,当添加leu时,αs1-casein的表达与p-mtor(ser2481)、p-s6k1(thr389)和p-eef2(thr56)成显著的正相关(p0.01)。综上所述,在乳腺上皮细胞中,leu能通过mtor信号通路促进酪蛋白合成相关因子的表达。试验二:本研究以体外培养的cmec-h细胞为模型,研究单一添加his对casein的合成及相关信号通路的影响。本研究以ebss溶液代替培养基,并设其为阴性对照,在此溶液基础上单一添加不同浓度的his,利用mtt法探讨添加不同浓度梯度的his添加水平以及培养时间(12h和24h)对cmec-h增殖的影响;同时运用qrt-pcr和wb检测casein和mtor信号路径元件因子表达。mtt的结果表明:与阴性对照组相比,添加0.15~9.60mmol/lhis时,cmec-h细胞数量增加,且添加不同时间(12h和24h)细胞增殖趋势一致;qrt-pcr的结果表明:当添加0.15~4.8mmol/lhis6h时,csn1s1、csn2和csn3基因表达均显著上调(p0.05)。当his的浓度为0.15~9.6mmol/l时,4ebp1、eef2、真核翻译起始因子4e(eif4e)和核糖体蛋白s6(rps6)基因的表达量随着his浓度的增加而增加,而mtor基因的表达量随着his浓度的增加而减少。当his的浓度为4.80mmol/l时,gβl基因的表达量最高;当his的浓度为1.20mmol/l时,s6k1基因表达量最高。wb结果表明,与阴性对照相比,当his浓度为0.15~9.6mmol/l时,αs2-casein、β-casein和κ-casein的表达量和p-mtor(ser2481)、p-raptor(ser792)、p-s6k1(thr389)、p-4ebp1(thr37)、p-eif4e(ser209)、p-eef2(thr56)的磷酸化随着his浓度的增加而增加(p0.01)。线性回归模型分析结果显示,当添加his时,β-casein(p0.01)和κ-casein(p0.01)与p-eef2的磷酸化成正相关。综上所述,在乳腺上皮细胞中,his能通过mtor信号通路促进酪蛋白合成相关因子的表达。试验三:奶牛日粮中不同eaa的配比对于提高乳蛋白产量十分重要。β-casein是一种具有高营养价值的乳蛋白。然而,在奶牛乳腺上皮细胞中,eaa的最优浓度配比对β-casein表达的影响的研究并不多。本研究以cmec-h细胞为模型,利用响应面中心复合设计(acentralcompositeexperimentaldesign,ccd)探究his,lys,met和leu这四种eaa的最优浓度配比,且阐明这四种eaa是通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mechanistictargetofrapamycincomplex1,mtorc1)信号通路调控β-casein的表达。以特殊培养基(不含所有AA)为阴性对照,运用WB的方法检测CCD的28组配比试验中,每一组β-casein的表达和mTORC1信号通路中相关蛋白磷酸化的变化。响应面结果表明:这四种EAA显著影响β-casein的表达(P0.01,R2=0.71)。其中当His:Lys:Met:Leu=5:6:1:7时,β-casein的表达量最高。只有Leu和Met在合成β-casein时存在负相关交互作用(P0.01)。进一步试验结果表明无论是单独添加这四种EAA还是添加最优浓度配比的EAA都会增加P-mTOR(Ser2481)、P-Raptor(Ser792)、P-S6K1(Thr389)、P-RPS6(Ser235/236)和P-eEF2(Thr56)的磷酸化。然而,当单独添加Lys、Met和Leu会抑制P-4EBP1(Thr37)的磷酸化。单独添加Met,会抑制P-eIF2α(Ser51)的磷酸化。当添加最优的浓度配比的混合EAA时,β-casein的表达量高达阳性对照(培养基中含有所有氨基酸)的98%。
【关键词】：组氨酸 赖氨酸 蛋氨酸 亮氨酸 mTOR 酪蛋白
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823.5
【目录】：

• 摘要4-7
• SUMMARY7-10
• 英文缩略图表10-16
• 第一章 绪论16-28
• 1.1 研究背景16-17
• 1.2 乳蛋白的成分和功能17-18
• 1.3 乳蛋白合成机理18-19
• 1.3.1 乳蛋白的来源18
• 1.3.2 乳腺细胞内蛋白质的合成18-19
• 1.4 乳腺中氨基酸的营养代谢19-21
• 1.4.1 乳腺中氨基酸的供给和摄取19-20
• 1.4.2 乳腺中氨基酸的代谢20-21
• 1.5 理想蛋白质模型及氨基酸平衡理论的提出21-22
• 1.6 氨基酸影响乳蛋白合成的主要信号转导通路22-25
• 1.6.1 m TOR信号转导通路22-24
• 1.6.2 EAA通过mTOR信号通路调控乳蛋白的合成24-25
• 1.7 永生化奶牛乳腺上皮细胞的系的应用及构建25-26
• 1.8 立题依据26
• 1.9 研究目的和意义26-27
• 1.10技术路线27-28
• 第二章 亮氨酸通过mTOR信号通路影响奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白的合成28-50
• 2.1. 引言28
• 2.2. 试验材料和方法28-38
• 2.2.1 主要仪器28-29
• 2.2.2 样品的准备29
• 2.2.3 奶牛乳腺上皮永生系细胞的培养29-30
• 2.2.4 MTT法检测细胞增殖30-31
• 2.2.5 qRT-RCR检测相关基因表达与分析31-35
• 2.2.6 Western Blot检测35-38
• 2.3 结果与分析38-48
• 2.3.1 亮氨酸对CMEC-H细胞增殖的影响38-39
• 2.3.2 亮氨酸在CMEC-H细胞中对酪蛋白合成的影响39-41
• 2.3.3 亮氨酸在CMEC-H细胞中对mTORC1表达的影响41-43
• 2.3.4 亮氨酸在CMEC-H细胞中对mTOR信号通路相关因子表达的影响43-46
• 2.3.5 在CMEC-H细胞中添加亮氨酸探究对酪蛋白的表达与mTOR信号通路相关蛋白磷酸化的相关性46-48
• 2.4 讨论48-49
• 2.4.1 亮氨酸对CMEC-H细胞增殖的影响48
• 2.4.2 亮氨酸对m TOR信号通路介导酪蛋白合成表达的影响48-49
• 2.4.3 亮氨酸对m TORC1信号通路相关因子表达的影响49
• 2.5 结论49-50
• 第三章 组氨酸通过mTOR信号通路影响奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白的合成50-66
• 3.1. 引言50
• 3.2. 试验材料和方法50-53
• 3.2.1 主要仪器50
• 3.2.2 样品的准备50
• 3.2.3 奶牛乳腺上皮永生系细胞的培养50
• 3.2.4 MTT法检测细胞增殖50-51
• 3.2.5 qRT-RCR检测相关基因表达与分析51-52
• 3.2.6 Western Blot检测52-53
• 3.3 结果与分析53-63
• 3.3.1 组氨酸对CMEC-H细胞增殖的影响53-54
• 3.3.2 组氨酸对CMEC-H细胞中酪蛋白相关因子表达的影响54-57
• 3.3.3 组氨酸对m TORC1相关因子表达的影响57-58
• 3.3.4 组氨酸在CMEC-H细胞中对mTOR信号通路相关因子表达的影响58-61
• 3.3.5 在CMEC-H细胞中添加组氨酸探究对酪蛋白的表达与mTOR信号通路相关蛋白磷酸化的相关性61-63
• 3.4 讨论63-64
• 3.4.1 组氨酸对CMEC-H细胞增殖的影响63-64
• 3.4.2 组氨酸对m TOR信号通路介导酪蛋白合成相关基因表达的影响64
• 3.4.3 组氨酸对m TORC1信号通路相关因子表达的影响64
• 3.5 结论64-66
• 第四章 组，，赖，蛋和亮氨酸最优配比模式通过mTOR信号通路调节乳腺上皮细胞中β -酪蛋白的表达66-84
• 4.1 引言66-67
• 4.2. 试验材料和方法67-72
• 4.2.1 主要仪器67
• 4.2.2 样品的准备67
• 4.2.3 奶牛乳腺上皮永生系细胞的培养67
• 4.2.4 试验一：MTT法检测细胞增殖67-68
• 4.2.5 Western Blot检测相关蛋白表达与分析68-72
• 4.3 结果与分析72-81
• 4.3.1 不同EAA对CMEC-H细胞增殖的影响72-73
• 4.3.2 单独添加亮、组、赖和蛋氨酸对 β-casein表达的影响73-74
• 4.3.3 利用响应面设计筛选 β-casein酪蛋白表达的最佳浓度配比模式74-79
• 4.3.4 最佳浓度配比EAA对 β-casein表达的影响79
• 4.3.5 亮、组、赖和蛋氨酸最佳浓度配比对m TORC1相关蛋白表达的影响6479-80
• 4.3.6 亮、组、赖和蛋氨酸最佳浓度配比对m TOR下游相关蛋白表达的影响80-81
• 4.4 讨论81-83
• 4.4.1 组、赖、蛋和亮氨酸对CMEC-H细胞增殖的影响81-82
• 4.4.2 组、赖、蛋和亮氨酸对CMEC-H中 β-酪蛋白合成的影响82
• 4.4.3 组、赖、蛋和亮氨酸对CMEC-H中mTORC1信号通路相关蛋白表达的影响82-83
• 4.5 结论83-84
• 第五章 全文总结84-85
• 参考文献85-92
• 致谢92-93
• 作者简历93-95
• 导师简介95-96

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