肌肉特异性表达MSTN siRNA与hF AD3在牛NCAPG-LCORL位点定点整合研究

发布时间：2017-09-01 07:07

  本文关键词：肌肉特异性表达MSTN siRNA与hF AD3在牛NCAPG-LCORL位点定点整合研究

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【摘要】：利用基因编辑技术可以实现多基因调控并培育转基因动物新品种。本研究利用CRISPR/Cas9技术,将肌肉特异性双向共表达打靶载体5arm-shRNA-MRF 4-MRF4-hFAD3-3arm(MSTN siRNA-hFAD3)定点整合入已证明的安全整合位点NCAPG-LCORL位点。研究MSTN siRNA-hFAD3表达对肌肉和脂肪酸相关基因的表达及n3多不饱和脂肪酸含量的影响,以期达到既促进肌肉发育,同时增加肌肉中n-3多不饱和脂肪酸,有效改善肉质、提高肉量的目的。结果表明：(1)CRISPR/Cas9成功介导MSTN siRNA-hFAD3肌肉特异性双向共表达载体在NCAPG-LCORL位点定点整合入牛细胞基因组。(2)MSTN siRNA-hFAD3基因的表达在细胞水平显示一定的肌肉特异性。(3)在定点整合的牛胎儿成纤维细胞及肌肉卫星细胞中,脂肪相关基因的表达结果显示,脂肪合成与脂肪分解的平衡向脂肪分解方向移动；肌肉发育相关基因表达量均上调；n6/n3比值均下降。(4)成功获得了6株同源重组阳性单克隆细胞株,并通过体细胞克隆制备转基因克隆胚胎。综上所述,肌肉特异性MSTN siRNA-hFAD3在转基因细胞中表达良好,可进一步用于转基因克隆牛的生产。
【关键词】：CRISP/Cas9 MSTN siRNA-hFAD3 NCAPG-LCORL 肌肉特异性
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;S823
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-10
• 缩略词表10-11
• 第一部分 试验研究 肌肉特异性表达MSTN siRNA与hFAD3在牛NCAPG-LCORL位点定点整合研究11-56
• 前言11-13
• 1 材料与方法13-32
• 1.1 主要试剂及耗材13
• 1.2 方法13-32
• 2 结果32-48
• 2.1 MRF4启动子细胞水平验证结果32-34
• 2.2 gRNA的设计及切割载体的构建结果34-35
• 2.3 打靶载体的构建及鉴定结果35-39
• 2.4 细胞水平的功能验证结果39-43
• 2.5 单克隆细胞筛选结果43-47
• 2.6 转基因克隆胚胎的生产47-48
• 3 讨论48-51
• 3.1 整合位点的选择及打靶载体的构建48
• 3.2 肌肉特异性双向共表达载体对相关基因表达的影响48-50
• 3.3 肌肉特异性双向共表达载体对脂肪酸中n6/n3比值的影响50
• 3.4 转基因单克隆细胞克隆胚胎的发育效率50-51
• 4 结论51-52
• 参考文献52-56
• 第二部分 文献综述 CRISPR/Cas9在哺乳动物基因组定点编辑的研究进展56-67
• 1 CRISPR/Cas系统的发展历程56-57
• 2 新型CRISPR/Cas9系统57-59
• 2.1 Cas9 nickase (Cas9n)57
• 2.2 Dead Cas9 (dCas9)57-58
• 2.3 Light-activated Cas958-59
• 3 CRISPR/Cas9在哺乳动物基因组定点编辑中的应用59-62
• 3.1 CRISPR/Cas9在哺乳动物基因组定点敲除中的应用60-61
• 3.2 CRISPR/Cas9在哺乳动物基因组定点敲入中的应用61-62
• 4 结语62-63
• 参考文献63-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士学位期间发表的论文68

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1 郭晶;肌肉特异性表达MSTN siRNA与hF AD3在牛NCAPG-LCORL位点定点整合研究[D];内蒙古大学;2016年

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本文编号：770634