外源基因VEGF在转基因绒山羊中的表达和遗传稳定性研究

发布时间：2017-09-06 03:10

  本文关键词：外源基因VEGF在转基因绒山羊中的表达和遗传稳定性研究

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【摘要】：血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF),是一种可以在动物毛囊中表达的毛乳头细胞自分泌生长因子。研究表明,VEGF基因可以在体内诱导血管新生,对于动物毛囊发育和毛发生长起重要作用。因此本实验室选择VEGF基因作为外源基因对阿尔巴斯白绒山羊进行转基因培育,期望获得高产绒量的转基因绒山羊,并为进一步探索VEGF基因在动物体内的作用机理提供实验依据。本实验室近年来通过体细胞克隆技术获得的VEGF转基因绒山羊中,有羊绒产量显著提高和羊绒产量未出现明显改善的转基因绒山羊,并且成年转基因绒山羊通过有计划的配种产生了子代羊。本实验选择了一只产绒量显著提高的转基因绒山羊(1号)及其两只子代(2号、3号)和一只产绒量未见明显改善的转基因绒山羊(4号)及其两只子代(5号、6号)进行检测,并与来自于同一细胞系的体细胞克隆绒山羊(7号)进行对比,确定外源VEGF基因在不同代次转基因绒山羊体内的遗传效率、表达量,为深入探索外源基因在转基因动物中的遗传规律提供实验依据。本实验从DNA、RNA、蛋白质三个水平对转实验样本进行检测,检测结果如下：(1)通过PCR鉴定,1号、2号、3号、4号羊呈转基因阳性。5号、6号羊呈转基因阴性。(2)使用Glucagon基因作为内参、绝对定量PCR法对外源VEGF基因拷贝数进行检测。得到标准曲线公式：log2N=-0.3879ΔCt+0.3122 (R2=0.9978, p0.001)计算得到各转基因绒山羊的外源基因拷贝数分别为：1号,1.235；2号,0.977；3号0.962；4号,1.884。1号、2号、3号羊外源基因为单拷贝,4号羊为双拷贝。(3)以GAPDH基因作为内参,使用Real-time-PCR和western blot对外源基因表达量进行检测。结果显示,与7号体细胞克隆羊相比,转基因绒山羊皮肤组织中外源VEGF基因mRNA及蛋白表达量分别是：1号,3.53倍、2.93倍；2号,2.78倍、2.56倍；3号,0.95倍、1.24倍；4号,1.23倍、1.03倍；5号,0.78倍、0.96倍；6号,1.02倍、0.72倍。转基因绒山羊血液中外源VEGF基因mRNA及蛋白表达量分别是：1号,0.57倍、0.98倍；2号,0.78倍、0.87倍；3号,0.69倍、1.12倍；4号,0.32倍、0.94倍；5号,0.91倍、1.12倍；6号,0.89倍、0.83倍。以上结果显示,外源VEGF基因在转基因绒山羊中的表达具有皮肤组织特异性,并且部分转基因绒山羊外源基因可以遗传给下一代转基因绒山羊。外源基因的表达量和遗传效率与拷贝数没有直接关系。上述实验结果为今后深入研究外源基因在转基因动物中的遗传规律打下了基础。
【关键词】：转基因绒山羊 外源基因 拷贝数 表达 遗传效率
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827;Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 文献综述12-19
• 1 转基因动物制备的主要方法12-14
• 1.1 显微注射法12
• 1.2 体细胞核移植12-13
• 1.3 逆转录病毒感染法13
• 1.4 胚胎干细胞法13
• 1.5 人工酵母染色体(YAC)法13-14
• 1.6 精子载体法14
• 2 外源基因在转基因动物中表达和遗传的稳定性14-17
• 2.1 位置效应15
• 2.2 外源基因的表观遗传学修饰15-16
• 2.3 外源基因遗传的稳定性16-17
• 3 结语17-19
• 第二章 VEGF转基因绒山羊阳性鉴定及拷贝数测定19-35
• 1 实验材料21-22
• 1.1 实验仪器21
• 1.2 实验试剂与耗材21
• 1.3 实验材料21-22
• 2 实验方法22-29
• 2.1 PCR转基因阳性鉴定22-25
• 2.1.1 血液基因组DNA提取22-23
• 2.1.2 PCR引物设计23-24
• 2.1.3 PCR反应体系24-25
• 2.1.4 PCR产物电泳25
• 2.1.5 凝胶成像25
• 2.2 绝对定量PCR法检测转基因绒山羊外源基因拷贝数25-29
• 2.2.1 绝对定量PCR反应标准品制备25-26
• 2.2.2 制作绝对定量PCR标准曲线26
• 2.2.3 质粒提取26-27
• 2.2.4 绝对定量PCR引物设计27
• 2.2.5 实时定量PCR反应体系及反应程序27-29
• 3 实验结果29-33
• 3.1 PCR鉴定结果29-30
• 3.2 绝对定量PCR检测结果30-33
• 3.2.1 绝对定量PCR结果30-32
• 3.2.2 拷贝数检测结果32-33
• 4 讨论33-35
• 第三章 VEGF转基因绒山羊外源基因表达量检测35-49
• 1 实验材料36-37
• 1.1 主要仪器36
• 1.2 实验试剂与耗材36
• 1.3 实验液体配制36-37
• 2 实验方法37-43
• 2.1 Real-time-PCR检测皮肤及血液RNA表达量37-40
• 2.1.1 皮肤组织RNA提取37-38
• 2.1.2 血液RNA提取38
• 2.1.3 RT-PCR(reverse transcription PCR)38-39
• 2.1.4 PCR引物设计39
• 2.1.5 Real-time-PCR反应体系39-40
• 2.2 Western blot检测皮肤及血液VEGF蛋白表达量40-43
• 2.2.1 皮肤组织蛋白质的提取40-41
• 2.2.2 血液组织蛋白质的提取41
• 2.2.3 Western blot检测VEGF蛋白表达量41-43
• 3 实验结果43-47
• 3.1 Real-time-PCR检测结果43-45
• 3.1.1 Real-time-PCR产物特异性检测43
• 3.1.2 Real-time-PCR检测皮肤组织mRNA表达量43-44
• 3.1.3 Real-time-PCR检测血液mRNA表达量44-45
• 3.2 Western blot检测结果45-47
• 3.2.1 Western blot检测皮肤组织蛋白表达量45-46
• 3.2.2 Western blot检测血液蛋白表达量46-47
• 4 讨论47-49
• 结论49-50
• 参考文献50-57
• 致谢57

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