氨基胍对IL-1β诱导下大鼠软骨细胞核转录因子通路的影响

发布时间：2017-09-06 14:38

  本文关键词：氨基胍对IL-1β诱导下大鼠软骨细胞核转录因子通路的影响

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【摘要】：通过白介素-1β(IL-1β)诱导大鼠原代软骨细胞,模拟骨关节炎中软骨细胞,研究氨基胍(AG)对IL-1β诱导的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧酶-2(COX-2)表达及NF-kB信号转导通路的影响,探讨AG是否能有效抑制IL-1β诱导的软骨细胞NF-kB信号转导通路,为氨基胍治疗骨关节炎提供有效的实验依据。以体外培养的SD大鼠髋关节软骨的第3代的大鼠软骨细胞为研究对象,根据氨基胍、IL-1β的浓度和其作用细胞的时间,实验分为X、Z组。X组分为5个亚组,包括A1组(不加任何刺激因子)、B1组(10 ng/mL IL-1β)、D1组(10 ng/mL IL-1β和0.3 mM AG)、D3组(10 ng/m L IL-1β和1 mM AG)、D5组(10 ng/m L IL-1β和3 mM AG)。将各亚组与细胞一起孵育2h。Z组分为6个亚组,包括A2组(不加任何刺激因子)、B2组(10 ng/m L IL-1β)、C组(3mM AG)、D2组(10 ng/m L IL-1β和0.3 mM AG)、D4组(10 ng/m L IL-1β和1 mM AG)、D6组(10 ng/m L IL-1β和3 mM AG)。将各亚组与细胞一起孵育24h。通过蛋白质免疫印迹检测软骨细胞中p-IKKα/β、p-p65、p65、IκBα、p-IκBα、i NOS和COX-2表达;免疫组化法检测p65核移位。实验结果显示:(1)与IL-1β处理组相比,不同浓度(0.3 mM、1 mM、3 mM)的AG能促使IL-1β诱导下p-IKKα/β和p-IκBα蛋白量均显著降低,p65和IκBα的蛋白量均显著升高,p0.01。当AG浓度为0.3 mM时,p-p65蛋白量没有明显变化,p0.05;AG浓度为1 mM和3 mM时,p-p65蛋白的量均显著降低。当AG浓度为1 mM时,细胞内p-IKKα/β、p-IκBα和p-p65蛋白量均达到最低,p65和IκBα蛋白量均达到最高。(2)与IL-1β处理组相比,3 mM AG作用于软骨细胞,软骨细胞胞浆i NOS和COX-2蛋白含量显著降低,p0.01;不同浓度(0.3 mM、1 mM、3 mM)的AG能促使IL-1β诱导下i NOS和COX-2表达量均显著降低,p0.01。并且随着AG浓度的增高,抑制效果逐渐增强。(3)IL-1β诱导下SD大鼠关节软骨细胞的胞核呈现黄绿色,p65集中在细胞核内。IL-1β和AG共同作用软骨细胞后,细胞质呈现黄绿色,p65集中在细胞质内,表明AG明显抑制了IL-1β诱导下NF-κB/p65核转位。本实验研究表明氨基胍通过抑制NF-κB信号转导途径,下调IL-1β诱导大鼠软骨细胞合成i NOS和COX-2,从而保护软骨细胞免受破坏作用。
【关键词】：氨基胍 大鼠软骨细胞 白介素-1β NF-κB信号通路 环氧合酶-2
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S857.16
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 引言11-22
• 1.1 骨关节炎概述11-19
• 1.1.1 关节结构变化11-12
• 1.1.2 骨关节炎发病原因12
• 1.1.3 骨关节炎发病机制12-16
• 1.1.4 骨关节炎介导软骨代谢失衡的相关信号通路16-19
• 1.2 氨基胍研究进展19-20
• 1.2.1 氨基胍的药用价值19
• 1.2.2 氨基胍的药理活性19-20
• 1.2.3 氨基胍与骨关节炎20
• 1.3 本实验研究目的及意义20-22
• 2 材料与方法22-31
• 2.1 实验仪器与试剂22-24
• 2.1.1 主要仪器22
• 2.1.2 主要化学试剂和生物耗材22-23
• 2.1.3 主要试剂的配制23-24
• 2.2 大鼠软骨细胞的培养与处理24-25
• 2.2.1 实验前的准备工作24
• 2.2.2 大鼠软骨细胞的培养24-25
• 2.3 实验分组25-26
• 2.4 软骨细胞鉴定26
• 2.4.1 软骨细胞II型胶原免疫组化鉴定26
• 2.4.2 软骨细胞蛋白多糖鉴定26
• 2.5 CCK8法检测细胞活性变化26-27
• 2.6 各组软骨细胞中目的蛋白含量的测定27-29
• 2.6.1 Western及IP细胞裂解方法提取各组细胞的总蛋白27
• 2.6.2 各组中样品浓度测定27
• 2.6.3 蛋白样品的处理27-28
• 2.6.4 Western Blot检测目的蛋白28-29
• 2.7 软骨细胞NF-κB核转位免疫组化实验29-30
• 2.8 实验数据的分析与统计30-31
• 3 实验结果31-40
• 3.1 软骨培养及细胞鉴定31-32
• 3.1.1 软骨细胞培养形态观察31
• 3.1.2 甲苯胺兰染色31-32
• 3.1.3 II型胶原免疫组化染色32
• 3.2 不同浓度氨基胍对软骨细胞活力的影响32-33
• 3.3 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞NF-κB信号通路的影响33-38
• 3.3.1 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠软骨细胞p-IKKα/β的表达影响33-34
• 3.3.2 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞IκBα的表达影响34-35
• 3.3.3 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞p-IκBα的表达影响35-36
• 3.3.4 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠软骨细胞p65的表达影响36
• 3.3.5 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞p-p65的表达影响36-37
• 3.3.6 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞NF-κB的核转位的影响37-38
• 3.4 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞i NOS的表达影响38-39
• 3.5 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞COX-2 的表达影响39-40
• 4 讨论40-45
• 4.1 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞NF-κB信号通路的影响40-42
• 4.1.1 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠软骨细胞p-IKKα/β的表达影响40-41
• 4.1.2 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞p-IκBα和IκBα的表达影响41
• 4.1.3 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞p-p65和p65的表达影响41-42
• 4.1.4 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞NF-κB p65核移位的影响42
• 4.2 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞i NOS的表达影响42-43
• 4.3 氨基胍对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞COX-2 的表达影响43-45
• 5 结论45-46
• 致谢46-47
• 参考文献47-57
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文57

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本文编号：803712