柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4功能特性的初步研究

发布时间：2017-09-06 15:42

  本文关键词：柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4功能特性的初步研究

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【摘要】：本文以对鸡危害最为严重的E.tenella为研究对象,对E.tenella新基因EtCDPK4特性、酶活性及在E.tenella发育过程中所执行的功能进行了研究和分析,为探讨E.tenella入侵宿主细胞的机制和研制高效、安全的抗球虫疫苗和新药物奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因的克隆及生物信息学分析利用3’-和5’-RACE技术获得EtCDPK4的全长cDNA序列,该序列大小是2 499 bp,包括5’-端185bp UTR序列,不含有CAAT和TATA序列;3’-端UTR序列,长511 bp,含Ploy(A)尾,没有典型AATAAA序列;ORF长1 803 bp,编码600个氨基酸,预测分子量68.3 kDa;对EtCDPK4编码蛋白的跨膜结构、疏水性、信号肽、理化性质、抗原位点和保守功能模块进行预测。结果显示:该基因编码蛋白没有信号肽和跨膜结构域,可能有16个抗原位点,推测具有良好抗原性。功能结构域分析EtCDPK4可能含2个N-端糖基化位点,3个N-端豆蔻酰化位点,7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,10个蛋白激酶C磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点,5个EF-Hand模体Ca2+结合结构域。该基因编码蛋白具有CDPKs家族成员特征性保守结构域。利用qRT-PCR检测EtCDPK4在E.tenella 4个不同发育阶段转录水平差异,结果表明EtCDPK4在E.tenella孢子化卵囊和子孢子阶段均有转录,且子孢子阶段转录水平最高,与孢子化卵囊阶段相比差异极显著。2.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4重组蛋白表达及其特性的初步研究将EtCDPK4连接到原核表达载体pColdⅠ中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经1 mmol/L IPTG诱导表达可溶性重组蛋白His-EtCDPK4(rEtCDPK4)。利用Ni柱亲和层析纯化rEtCDPK4,纯化的可溶性蛋白免疫新西兰大白兔获得兔抗重组蛋白多克隆抗体IgG,经western-blot分析表明rEtCDPK4具有良好的抗原性。利用IFA技术对EtCDPK4天然蛋白在球虫入侵DF-1细胞后不同发育阶段分布和定位进行分析,结果显示,该蛋白主要位于E.tenella子孢子和第二代裂殖子核前端膜表面;当子孢子入侵DF-1细胞12 h后,蛋白主要位于虫体顶端和带虫空泡膜上,此时表达量极速增加;子孢子入侵DF-1细胞36 h后,表达量下降,主要位于滋养体边缘;虫体刚发育至未成熟裂殖体时,蛋白表达量迅速增加,蛋白均匀分布于整个虫体,当虫体发育为中等阶段未成熟裂殖体时,表达量降低,发育为成熟裂殖体时,表达量又迅速上升,绿色荧光强度变强变亮。E.tenella子孢子入侵DF-1细胞体外抑制实验显示,使用兔抗rEtCDPK4多克隆抗体处理E.tenella子孢子后,与正常兔血清IgG对照组相比子孢子入侵DF-1活力显著减弱,且随着抗体处理子孢子浓度不断增大,入侵细胞能力逐渐降低,当抗体浓度为400μg/mL时,抑制率高达52%。通过免疫印迹检测E.tenella 4个发育阶段EtCDPK4翻译水平结果显示,EtCDPK4蛋白在E.tenella 4个不同发育阶段均有翻译,但在E.tenella第二代裂殖子中翻译水平最高。3.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4催化活性的初步研究通过构建体外磷酸化反应体系,探究了可溶性rEtCDPK4的酶催化活性特性、不同Ca2+浓度对rEtCDPK4酶活性大小影响以及rEtCDPK4酶活性特异性抑制剂的体外筛选和体内临床验证。结果表明,rEtCDPK4酶活性大小在0.87 nmol·min-1·ml-1左右;rEtCDPK4蛋白激酶活性正常发挥要完全依赖于酶活反应体系中Ca2+,当Ca2+浓度为0时,rEtCDPK4没有任何酶活性,不能够使底物短多肽磷酸化,随着酶活反应缓冲溶液中Ca2+浓度不断升高,可以明显看到rEtCDPK4的酶反应催化活性是不断的增强的;通过体外磷酸化酶活性反应的筛选和E.tenella子孢子体外入侵抑制实验的临床验证,筛选出4种效果较好的EtCDPK4酶催化活性抑制剂,分别是:W-7、H-7、H-89以及Myristoylated Protein Kinase Peptide Inhibitor。这4种抑制剂都能够在一定程度上有效抑制E.tenella子孢子入侵DF-1细胞的能力。4.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4相互作用底物的筛选为了获得E.tenella子孢子或第二代裂殖子入侵阶段EtCDPK4的相互作用蛋白,构建了EtCDPK4的BD诱饵质粒,利用酵母双杂交技术将BD诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4筛选E.tenella子孢子或第二代裂殖子酵母双杂交cDNA文库获得与EtCDPK4相互作用的底物蛋白。将构建的BD诱饵蛋白进行自激活活性、细胞毒性及诱饵蛋白c-Myc-EtCDPK4是否在宿主酵母菌中表达进行检测。结果表明,构建的酵母BD诱饵蛋白没有自激活活性、细胞毒性且在酵母中能表达,因此可用于酵母双杂交筛选。通过使用BD诱饵蛋白对E.tenella子孢子或第二代裂殖子酵母双杂交cDNA文库的筛选,在SD/-Ade/-Trp/-His/-Leu/X-α-GAL缺陷性固体培养基上共获得88个蓝色酵母单克隆菌落,其中80个成功转化大肠杆菌TOP10进行测序;序列经BLAST分析后,得到10个可能与EtCDPK4相互作用的蛋白,包括未知基因9个,已知基因1个,未命名蛋白6个,4个已报道蛋白,即EtSerpin,Etm094G10,Etm109G06,EtGMP。利用Co-IP的方法验证了EtCDPK4和EtSerpin相互作用关系,结果表明EtCDPK4与EtSerpin存在相互作用关系。
【关键词】：柔嫩艾美耳球虫 钙依赖蛋白激酶4 酶活测定 入侵 抑制剂 酵母双杂交
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-18
• 第一章 文献综述18-25
• 1.1 钙调素（CaM）18-19
• 1.1.1 钙调素的结构和功能18-19
• 1.1.2 钙调素在生物体中的分布以及作用机制19
• 1.1.3 钙调素在寄生虫中所起的作用19
• 1.2 钙网织蛋白（CRT）19-21
• 1.2.1 钙网织蛋白的结构和功能19-20
• 1.2.2 钙网织蛋白在细胞中的分布以及作用机制20
• 1.2.3 钙网织蛋白在寄生虫中所起的作用20-21
• 1.3 钙依赖蛋白激酶（CDPKS）21-22
• 1.3.1 钙依赖蛋白激酶的结构和功能21
• 1.3.2 钙依赖蛋白激酶在生物体中的分布以及作用机制21-22
• 1.3.3 钙依赖蛋白激酶在寄生虫中所起的作用22
• 1.4 膜联蛋白（Annexin）22-23
• 1.4.1 膜联蛋白的结构与功能22-23
• 1.4.2 膜联蛋白在生物体中的分布以及作用机制23
• 1.4.3 膜联蛋白在寄生虫中所起的作用23
• 1.5 展望23-25
• 第二章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因的克隆及生物信息学分析25-48
• 2.1 引言25
• 2.2 材料与方法25-39
• 2.2.1 实验动物25-26
• 2.2.2 实验虫株26
• 2.2.3 实验所需主要试剂26
• 2.2.4 主要实验所需仪器26-27
• 2.2.5 实验所需试剂配制方法27
• 2.2.6 柔嫩艾美耳球虫4个不同发育阶段虫体的收集与纯化27-29
• 2.2.7 柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA的抽提29-30
• 2.2.8 柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA末端快速扩增法（RACE）模板的制备30-32
• 2.2.9 目的基因cDNA 5’-末端和 3’-末端序列的扩增32-35
• 2.2.10 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4蛋白基因的生物信息学分析35
• 2.2.11 反转录合成与制备柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段cDNA模板35
• 2.2.12 柔嫩艾美耳球虫目的基因EtCDPK4完整开放阅读框的PCR扩增35-36
• 2.2.13 钙依赖蛋白激酶4在柔嫩艾美耳球虫4个不同发育阶段转录水平的差异分析36-39
• 2.3 结果39-46
• 2.3.1 纯化和收集柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的虫体39
• 2.3.2 柔嫩艾美耳球虫虫体总RNA的提取39-40
• 2.3.3 柔嫩艾美耳球虫EtCDPK4基因的克隆40-41
• 2.3.4 柔嫩艾美耳球虫EtCDPK4基因的生物信息学预测和分析41-46
• 2.3.5 柔嫩艾美耳球虫EtCDPK4在4个不同发育阶段的转录水平差异分析46
• 2.4 讨论46-48
• 第三章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4蛋白表达及其特性的初步研究48-74
• 3.1 引言48
• 3.2 材料与方法48-62
• 3.2.1 实验动物48
• 3.2.2 实验寄生虫虫株、载体和细胞48
• 3.2.3 实验所需试剂48-49
• 3.2.4 实验所需主要仪器设备49
• 3.2.5 主要实验所需试剂的配制方法49-51
• 3.2.6 重组表达系统pColdⅠ-EtCDPK4和pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4构建与鉴定51-52
• 3.2.7 重组表达质粒pColdⅠ-EtCDPK4和pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4的表达52-54
• 3.2.8 原核表达系统pColdⅠ-EtCDPK4表达重组蛋白的纯化54-55
• 3.2.9 rEtCDPK4重组蛋白多克隆抗体的制备与抗体的纯化55-56
• 3.2.10 重组蛋白rEtCDPK4的免疫原性和反应原性检测分析56-58
• 3.2.11 DF-1 细胞的复苏与传代培养58
• 3.2.12 EtCDPK4在柔嫩艾美耳球虫入侵DF-1 不同发育阶段的分布与定位分析58-59
• 3.2.13 间接免疫荧光鉴定重组真核表达质粒pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4在DF-1中的表达情况59
• 3.2.14 兔抗rEtCDPK4重组蛋白多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1细胞的体外抑制分析59-60
• 3.2.15 EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球虫4个不同的发育阶段中蛋白质翻译水平的差异分析60-62
• 3.3 结果62-72
• 3.3.1 EtCDPK4原核表达重组质粒的构建62-63
• 3.3.2 EtCDPK4重组蛋白的诱导表达及其蛋白纯化63-65
• 3.3.3 兔抗rEtCDPK4多克隆抗体的制备65
• 3.3.4 rEtCDPK4重组蛋白免疫原性和反应原性的分析65-67
• 3.3.5 柔嫩艾美耳球虫虫体CDPK4天然蛋白的间接免疫荧光定位67-69
• 3.3.6 间接免疫荧光鉴定真核重组表达质粒pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4在DF-1细胞中的表达情况69-70
• 3.3.7 兔抗rEtCDPK4多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1 细胞的体外抑制实验70-71
• 3.3.8 柔嫩艾美耳球虫4个不同发育阶段中EtCDPK4蛋白翻译的分析71-72
• 3.4 讨论72-74
• 第四章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4催化活性初步研究74-86
• 4.1 引言74
• 4.2 材料与方法74-78
• 4.2.1 实验寄生虫虫株、细胞74
• 4.2.2 实验所需试剂74
• 4.2.3 实验所需主要仪器设备74-75
• 4.2.4 实验所需试剂的配制方法75
• 4.2.5 rEtCDPK4重组蛋白酶活性的测定75-77
• 4.2.6 不同Ca~(2+)浓度对rEtCDPK4酶催化活性大小的影响77
• 4.2.7 rEtCDPK4特异性抑制剂的筛选和显著性分析77-78
• 4.2.8 筛选出的rEtCDPK4酶活性抑制剂抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1细胞的体外入侵抑制试验78
• 4.3 结果78-83
• 4.3.1 rEtCDPK4酶活性的测定78-79
• 4.3.2 不同Ca~(2+)浓度对rEtCDPK4酶活性大小的影响79-81
• 4.3.3 rEtCDPK4特异性抑制剂的筛选和显著性分析81-82
• 4.3.4 筛选出的rEtCDPK4酶活性特异性抑制剂抑制子孢子对DF-1 细胞入侵试验82-83
• 4.4 讨论83-86
• 第五章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4相互作用底物筛选86-105
• 5.1 引言86
• 5.2 材料与方法86-96
• 5.2.1 实验所需酵母菌株、载体和细胞86-87
• 5.2.2 酵母双杂交筛选cDNA文库87
• 5.2.3 实验所需主要试剂87
• 5.2.4 实验所需主要仪器87
• 5.2.5 实验所需试剂的配制87-90
• 5.2.6 酵母诱饵Et CDPK4质粒的构建90
• 5.2.7 酵母菌株Y2HGold感受态细胞的制备90-91
• 5.2.8 BD诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4转化入酵母Y2HGold感受态细胞91-92
• 5.2.9 重组酵母诱饵菌的PCR鉴定92
• 5.2.10 诱饵pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold酵母菌报告基因自激活活性的检测92
• 5.2.11 诱饵pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold宿主酵母菌细胞毒性的检测92-93
• 5.2.12 诱饵pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold酵母宿主菌中蛋白表达情况的检测93-94
• 5.2.13 使用诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4靶菌株从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子酵母双杂交cDNA文库中筛选相互作用蛋白94-95
• 5.2.14 使用免疫共沉淀（Co-IP）验证其中一个筛选到的阳性克隆EtSerpin95-96
• 5.3 结果96-102
• 5.3.1 BD诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4的构建96-97
• 5.3.2 诱饵重组质粒pGBKT7-EtCDPK4转化Y2HGold酵母菌的PCR鉴定97-98
• 5.3.3 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold酵母菌报告基因自激活活性的检测98
• 5.3.4 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold宿主酵母菌细胞毒性的检测98-99
• 5.3.5 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold宿主酵母菌中蛋白表达情况的检测99-100
• 5.3.6 酵母双杂交筛选到的阳性质粒测序分析结果和杂交效率分析100-101
• 5.3.7 Co-IP验证EtCDPK4与阳性克隆EtSerpin相互作用关系101-102
• 5.4 讨论102-105
• 第六章 全文总结105-106
• 参考文献106-114
• 致谢114-115
• 作者简历115

【参考文献】

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本文编号：804004