牦牛轮状病毒的RT-PCR检测方法的建立和应用及病毒的分离培养

发布时间：2017-09-07 03:12

  本文关键词：牦牛轮状病毒的RT-PCR检测方法的建立和应用及病毒的分离培养

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【摘要】：犊牦牛腹泻一直是青藏高原牦牛养殖业面临的重要疾病,但由于病原学和流行病学资料匮乏,严重制约了该类疾病的防治。国内外的研究表明,轮状病毒(Rotavirus,RV)是重要的人畜致腹泻病毒,牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)是引起犊牛腹泻的主要病原之一。本实验室前期用宏病毒组技术鉴定牦牛腹泻相关病毒时,发现粪便样本中存在RV,但用国内外文献报道的3种检测BRV的RT-PCR方法却对测序证实的阳性样本不能检出,推测是由于病毒的序列变异所引起。本研究的目的是在研究牦牛RV VP6基因遗传变异的基础上,建立检测牦牛RV的RT-PCR方法,应用该方法对青藏高原牦牛腹泻样本进行RV的流行病学调查并进行病毒的分离鉴定。取得如下成果:1.检测牦牛轮状病毒的RT-PCR方法的建立RV VP6基因是11个基因节段中相对最保守的基因之一,是RV的主要分子检测靶点,但该基因的点突变会影响病毒的分子检测。因此,采用Prime5.0软件设计引物,首先从30个牦牛腹泻样本中扩增得到14个位于931bp~1338bp牦牛RV VP6基因片段。序列分析发现,与BRV相比,牦牛RV VP6基因在931bp~1110bp间出现多处点突变,而在1100bp~1338bp之间序列高度保守。据此设计检测引物,成功建立了检测牦牛RV的RT-PCR方法,具有良好的特异性和稳定性,只扩增出牦牛RV及BRV的特异片段,对其它无关病原无扩增;检测下限为0.45pg/μL,灵敏性较好。本方法对牦牛RV的检出率明显优于文献报道的检测BRV的RT-PCR方法,为牦牛RV病的诊断和流行病学调查提供了可靠的方法;该方法对肉牛腹泻样本中BRV的检出也与其它方法具有很好的符合率,说明该方法也可以用于BRV的检测。2.牦牛轮状病毒的病原流行病学调查为调查RV在青藏高原牦牛中的流行情况,分别2014年6月和2015年8月采集了四川省阿坝州地区4个牧场、云南香格里拉地区4个牧场、青海玉树地区5个牧场、西藏亚东地区6个牧场,共计234份犊牦牛("f3月龄)腹泻粪便样本,采用本实验建立的RT-PCR方法检测了RV在腹泻样本中的分布。结果表明:234份犊牦牛腹泻粪便样本的RV检出率为:西藏为60%(36/60)、青海为95%(57/60);四川为85.19%(46/54);云南为90%(54/60),证明牦牛RV感染是当前导致犊牦牛腹泻的重要原因。随机抽取的四个地区的阳性样本,对其VP6基因进行测序并建立系统发育树,结果显示,不同地区的牦牛RV单独的聚在一起,与BRV有明显的遗传距离,表明VP6的序列的变异与宿主有关。从四个地区的毒株分布来看,青海、西藏、云南的毒株分别单独聚在一起,四川的毒株则分布在西藏和云南的毒株形成的分支中,似乎有一定的地域分布的趋势,但还需要更多不同地域的毒株来验证。3.牦牛轮状病毒的分离鉴定阳性样本采用MA-104细胞进行牦牛RV的分离鉴定。分离培养的5个毒株已传代培养至第15代,没有一株出现细胞病变。收集的每一代细胞毒,经RT-PCR鉴定证实RV的存在。5个分离毒株均为I2基因型,其中有4个毒株扩增出了VP4基因:3个分离毒株为P[11]基因型,1个分离毒株为P[14]基因型。采用文献报道的多种方法均未能扩增出VP7基因,推测是序列变异造成。本结果为进一步研究牦牛RV的生物学特征奠定了基础。综上所述,本研究在对牦牛RV VP6基因遗传变异分析的基础上,成功建立了检测牦牛RV的RT-PCR检测方法,既可用于牦牛RV的快速诊断,又可用于BRV的快速诊断。病原流行病学调查表明,RV是牦牛腹泻的重要原因。分离得到的牦牛RV为进一步研究其生物学特征奠定了基础。
【关键词】：牦牛 轮状病毒 VP6基因 RT-PCR 流行病学调查 分离培养
【学位授予单位】：西南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.653
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-12
• 第1章 牛轮状病毒的分子生物学特性和检测方法的研究进展12-30
• 1 牛轮状病毒主要蛋白的分子生物学特性及遗传进化分析13-25
• 1.1 VP3结构蛋白的分子生物学特性及遗传进化分析14-15
• 1.2 VP4结构蛋白的分子生物学特性及遗传进化分析15-18
• 1.3 VP6结构蛋白的分子生物学特性及遗传进化分析18-21
• 1.4 VP7结构蛋白的分子生物学特性及遗传进化分析21-23
• 1.5 NSP4非结构蛋白的分子生物学特性及遗传进化分析23-25
• 2 牛轮状病毒检测方法的研究进展25-30
• 2.1 牛轮状病毒经典检测方法25-26
• 2.2 免疫学检测方法26-27
• 2.3 基因检测方法27-30
• 第2章 牦牛轮状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用30-41
• 1 材料与方法30-33
• 1.1 病毒（菌）株、临床样本30-31
• 1.2 主要试剂及仪器31
• 1.3 引物的设计与合成31
• 1.4 核酸的提取与cDNA合成31-32
• 1.5 牦牛RV阳性标准品的制备32
• 1.6 反应体系及条件的优化32
• 1.7 敏感性测定32
• 1.8 特异性评价32
• 1.9 稳定性评价32
• 1.10 四种RT-PCR方法的比较32-33
• 1.11 流行病学调查33
• 2 结果33-38
• 2.1 牦牛RV VP6基因片段序列的克隆及系统发育分析33-34
• 2.2 牦牛RV检测引物的特异性34-35
• 2.3 优化的RT-PCR反应体系及条件35-36
• 2.4 特异性36
• 2.5 稳定性36
• 2.6 本方法和文献中报道的检测BRV的方法的比较36
• 2.7 流行病学调查36-37
• 2.8 青藏高原四个地区的牦牛轮状病毒VP6基因片段的遗传进化分析37-38
• 3 讨论38-41
• 第3章 牦牛轮状病毒的分离鉴定与分子生物学特征研究41-54
• 1 材料与试剂41-42
• 1.1 临床样本及培养细胞41
• 1.2 主要试剂及仪器41-42
• 2 牦牛轮状病毒的分离培养及鉴定42-43
• 2.1 临床样本的前期处理42
• 2.2 病毒的分离培养42
• 2.3 分离病毒的RT-PCR鉴定42-43
• 3 分离毒株的VP4、VP6、VP7基因的克隆与遗传进化分析43-45
• 3.1 扩增引物的设计43-44
• 3.2 分离毒株的VP4、VP6、VP7基因的扩增与克隆测序44-45
• 3.3 分离毒株的VP4、VP6和VP7基因的同源性比对与遗传进化分析45
• 4 结果45-51
• 4.1 牦牛轮状病毒的分离鉴定45-47
• 4.2 VP4基因的遗传进化分析47-48
• 4.3 VP6基因的遗传进化分析48-51
• 4.4 VP7基因扩增结果51
• 5 讨论51-54
• 结论54-55
• 参考文献55-63
• 附录一63-64
• 致谢64-66

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