鸡生殖干细胞中Piwi基因的干涉效率
本文关键词：鸡生殖干细胞中Piwi基因的干涉效率
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【摘要】：【目的】针对禽类干细胞研究中,存在转染效率与干涉效率低下的问题,通过比较不同干涉方式对鸡原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)中Piwi基因的干涉效果,探讨提高禽类生殖干细胞干涉效率的有效方法。为进一步研究Piwi基因参与干细胞自我更新、RNA沉默以及转录后调控过程等生物学功能研究奠定基础。【方法】根据已建立的原代细胞分离技术,分别从健康鸡群的10日龄和4日龄鸡胚中分离成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)与生殖脊,其中CEF作为PGCs细胞的饲养层,生殖脊经Trypsin-EDTA室温下消化获得PGCs细胞,并通过形态学、化学方法(PAS糖原染色、AKP活性检测)和免疫学方法(TERT抗体、SSEA-1抗体)对其进行鉴定。根据Genbank公布的鸡Piwi基因的m RNA序列(NM_001098852),利用在线软件分别靶向不同位点设计合成得到3个小片段的stealth si RNAs,并将通用无义序列BLOCK-i T~(TM) Alexa Fluor#174;Red Fluorescent Oligo作为荧光素标记的阴性对照si RNA。同时,在线设计三条干扰序列和一条非特异性阴性对照序列,将其插入线性化空载体p RNA-U6.1,构建不同的sh RNA干涉载体。分别采用不同类型的转染试剂将构建好的si RNA和sh RNA转染PGCs细胞。首先利用通用无义si RNA以及仅带有GFP荧光标记基因的sh RNA载体作为阴性对照,检测si RNA和sh RNA转染效率,确定最佳转染条件。其次,将试验组si RNA和sh RNA在优化条件下转染PGCs细胞,分别收集转染了24、48、72和144 h这4个时间点的细胞,提取各个时间段的总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测Piwi基因m RNA表达水平,并用SPSS软件分析不同处理组的差异。【结果】在对原代分离的PGCs细胞进行了形态学、化学以及免疫学方法鉴定后,确认其所获得的细胞为PGCs细胞且状态良好。根据不同的转染试剂量与si RNA或sh RNA载体量的配比,得出si RNA转染最优条件为si RNA㑳Lipofectamine TM 2000=50 pmol㑳2μL;sh RNA转染最优条件为sh RNA㑳X-Treme GENE HP DNA Transfection Reagent=500 ng㑳1.5μL。在以上最优转染条件下,将试验组si RNA和sh RNA分别转染第二代PGCs细胞。发现在si RNA干涉组中,阴性si RNA组和空白组相比,Piwi基因表达量在24、48、72和144 h差异均不显著(P0.05);而3个试验组si RNA与阴性对照组相比,在24、48和72 h的Piwi基因表达量均呈现显著下降(P0.05),但在144 h时表达差异不显著(P0.05)。在sh RNA干涉组中,空白组和阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上差异均不显著(P0.05);而3个试验组与阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上均显著下降(P0.05)。与si RNA干涉试验组相比,sh RNA载体表现出更强及更长时间的稳定抑制Piwi基因的效果。【结论】si RNA与sh RNA均能较好抑制目的基因的m RNA表达,不同干涉效果表明采用sh RNA载体具有更好及更长时间的抑制作用,这为RNAi技术在家禽生殖干细胞中的应用研究提供基础资料。
【作者单位】： 扬州大学动物科学与技术学院;
【关键词】： Piwi基因 siRNA shRNA PGCs RNAi
【基金】：国家自然科学基金(31372297,31301966) 国家科技支撑计划项目(2015BAD03B03)
【分类号】：S831
【正文快照】： 0引言【研究意义】Piwi基因是Argonaute家族的一个亚家族,参与干细胞自我更新、RNA沉默以及转录后调控过程[1]。Piwi基因在原始生殖细胞(primordialgerm cell,PGCs)中为特异性表达,且容易体外获得与培养,在生殖干细胞的维持和精子发生方面发挥着重要作用[2]。鸡PGCs具有发育的
【参考文献】
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，本文编号：812595
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