脂质运载蛋白2（Lcn2）在早期妊娠小鼠子宫中的表达及功能

发布时间：2017-09-10 22:01

  本文关键词：脂质运载蛋白2（Lcn2）在早期妊娠小鼠子宫中的表达及功能

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【摘要】：胚胎着床是具有着床能力的胚胎与具有接受能力的子宫相互作用的过程,二者相互独立但又必须同步,对早期妊娠的确立极为重要。着床发生后,胚胎逐渐侵入到子宫内膜中,使基质细胞发生广泛地增殖及分化,这一过程称之为蜕膜化。脂质运载蛋白2(Lipocalin-2,Lcn2)是一种分泌型的脂质转运蛋白,与炎症、感染及肿瘤转移等病理过程相关,能运输白三烯、血小板活化因子等亲脂性分子。Lcn2在小鼠的发情前期及发情期、小鼠妊娠前两天的子宫腔上皮及腺上皮都有较强的表达,但在小鼠早期妊娠过程中的调节及功能仍不清楚。本研究对Lcn2在早期妊娠小鼠子宫中的表达、调节及功能做了进一步的分析。我们采用原位杂交的方法,检测了Lcn2在小鼠早期妊娠、假孕、延迟激活着床及人工诱导蜕膜化中mRNA水平表达。结果显示,Lcn2在小鼠早期妊娠第1~2天的子宫腔上皮中强表达,第3~4天逐渐减弱,第4天几乎不表达。在卵巢切除小鼠中,Lcn2对雌激素的刺激极为敏感,并表现出一定的时间依赖性,在24小时达到峰值。利用雌激素受体(estrogen receptor,ER)激动剂及ERα敲除小鼠证实,雌激素主要通过ERα调节Lcn2。大肠杆菌及金黄色葡萄球菌可诱导Lcn2在子宫中的表达。LPS也可刺激Lcn2在子宫上皮大量表达。前列腺素对于起始着床和蜕膜化具有重要作用,Lcn2在妊娠第5天子宫中的表达位置与mPGES1类似,都在胚胎周围的基质细胞中表达,而非着床点都不表达。在基质细胞中加入Lcn2重组蛋白可使mPGES1的表达量增加,干涉Lcn2后mPGES1的表达量有所降低。mPGES1是合成PGE2的终端限速酶,Lcn2在胚胎着床前后可能通过调节mPGES1的表达控制PGE2的合成,有助于血管的通透性增强,促进胚胎着床。在小鼠基质细胞中,孕酮能显著性地诱导Lcn2上调,但加入其受体抑制剂RU486后可阻断对Lcn2的诱导作用。Lcn2启动子上存在c-Myc结合位点,c-Myc又是Akt下游的一个靶分子,在加入Akt及c-Myc抑制剂后,可阻断孕酮对基质细胞中Lcn2表达的诱导作用,表明孕酮在基质细胞中可通过Akt-c-Myc通路调节Lcn2的表达。
【关键词】：脂质运载蛋白2 胚胎着床 细胞增殖 炎症
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S814
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 中英文缩略词表6-10
• 1 前言10-18
• 1.1 胚胎着床及蜕膜化10-11
• 1.2 胚胎着床及蜕膜化相关分子11-14
• 1.2.1 类固醇激素及其受体11-12
• 1.2.2 Lif/Stat3信号通路12-13
• 1.2.3 前列腺素类13-14
• 1.3 Lcn2研究进展14-18
• 1.3.1 Lcn2的结构及生物学特性14-15
• 1.3.2 调节Lcn2的相关分子15-16
• 1.3.3 Lcn2与肾脏损伤16
• 1.3.4 Lcn2与脂质代谢16-17
• 1.3.5 Lcn2与癌症17
• 1.3.6 Lcn2与生殖17-18
• 1.4 本研究的目的和意义18
• 2 材料与方法18-37
• 2.1 实验动物18
• 2.2 实验材料的收集18
• 2.3 动物模型的建立18-20
• 2.3.1 早期妊娠18-19
• 2.3.2 假孕小鼠模型19
• 2.3.3 延迟和激活模型19
• 2.3.4 人工诱导蜕膜化19-20
• 2.3.5 类固醇激素处理20
• 2.3.6 LPS处理20
• 2.3.7 大肠杆菌及金黄色葡萄球菌处理假孕小鼠20
• 2.4 原位杂交探针制备20-26
• 2.4.1 菌种和主要试剂20
• 2.4.2 PCR引物设计20-21
• 2.4.3 总RNA的提取21-22
• 2.4.4 RNA反转录合成cDNA22
• 2.4.5 PCR扩增22-23
• 2.4.6 PCR产物凝胶电泳23
• 2.4.7 PCR产物胶回收23
• 2.4.8 PCR产物与pGEM-T载体的连接23-24
• 2.4.9 重组质粒的转化及鉴定24-25
• 2.4.10 阳性克隆质粒的提取25
• 2.4.11 目的片段的扩增、回收、提纯25-26
• 2.4.12 地高辛标记cRNA探针26
• 2.5 原位杂交26-30
• 2.5.1 原位杂交相关器皿的准备26-27
• 2.5.2 原位杂交相关试剂的配制27-29
• 2.5.3 冰冻切片29
• 2.5.4 原位杂交步骤29-30
• 2.6 Western Blot30-35
• 2.6.1 Western Blot相关试剂配制30-33
• 2.6.2 蛋白样品的制备33
• 2.6.3 蛋白浓度的测定33-34
• 2.6.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳34
• 2.6.5 Western Blot流程34-35
• 2.7 小鼠子宫内膜基质细胞的分离培养及处理35-36
• 2.7.1 细胞培养的准备工作35
• 2.7.2 基质细胞原代培养35-36
• 2.7.3 体外诱导蜕膜化及P4处理36
• 2.7.4 Lcn2 siRNA转染36
• 2.8 Real-time RT-PCR36-37
• 2.8.1 Real-time PCR实验步骤36-37
• 2.8.2 数据分析37
• 2.9 统计学分析37
• 3 结果37-53
• 3.1 Lcn2原位杂交探针的制备37-39
• 3.2 Lcn2在早期妊娠小鼠子宫中的表达39-40
• 3.3 Lcn2在假孕小鼠子宫中的表达40-41
• 3.4 Lcn2在延迟与激活着床子宫中的表达41
• 3.5 Lcn2在人工诱导蜕膜化中的表达41-42
• 3.6 雌激素及其受体对Lcn2表达的影响42-45
• 3.6.1 类固醇激素对Lcn2表达的影响42-43
• 3.6.2 E2处理不同时间对子宫中Lcn2表达的影响43-44
• 3.6.3 ER受体激动剂对Lcn2表达的影响44-45
• 3.6.4 E2在ERα 敲除鼠中对Lcn2表达的影响45
• 3.7 小鼠基质细胞分离效果鉴定45-46
• 3.8 基质细胞中孕酮对Lcn2表达的调节46-48
• 3.8.1 体外诱导蜕膜化对Lcn2表达的调节46-47
• 3.8.2 P4在基质细胞中对Lcn2的调节47-48
• 3.9 PI3K/Akt-c-Myc参与P4对Lcn2的调节48
• 3.10 Lcn2在基质细胞中对mPGES1的调节48-51
• 3.11 LPS对Lcn2及mPGES1的调节51
• 3.12 大肠杆菌及金黄色葡萄球菌对Lcn2的刺激作用51-53
• 4 讨论53-56
• 4.1 Lcn2可能参与子宫上皮细胞的增殖53-54
• 4.2 Lcn2可能对维持子宫内微环境的稳定具有重要作用54-55
• 4.3 Lcn2在小鼠基质细胞中可能促进PGE2的合成55-56
• 4.4 在基质细胞中P4通过Akt-c-Myc调节Lcn256
• 5 结论56-57
• 致谢57-58
• 参考文献58-64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 须静;胡晓波;;中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的研究进展[J];检验医学;2012年10期

2 韩丙辰;杨增明;;子宫内膜蜕膜化的特征及其调节因素[J];细胞生物学杂志;2007年05期

3 沈佳,张永莲,刘强,赵健;猴附睾特异性表达基因LCN6第5号内含子的克隆及分析[J];华东理工大学学报(自然科学版);2005年03期

4 范衡宇,杨增明;环氧合酶(COX)与哺乳动物生殖[J];生殖与避孕;2000年06期

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本文编号：826848