环形病毒AGV2的检测及其VP1-3基因表达

发布时间：2017-09-10 23:23

  本文关键词：环形病毒AGV2的检测及其VP1-3基因表达

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【摘要】：鸡传染性贫血病毒(CAV)是圆环病毒科环形病毒属中最早被鉴定,也是目前该属中唯一经细胞培养分离到的成员。自2011年,CAV相关的环形病毒序列AGV2,不仅在鸡体中被鉴定,而且在人的皮肤棉试、血液以及粪便样品中被检测到。提示,研究AGV2具有潜在的公共卫生意义。那么,AGV2是否与CAV一样,对雏鸡具有致病性,能诱导免疫抑制?AGV2在国内鸡群的分子流行情况又是如何?这些问题均有待进一步阐明。为探究国内鸡群及人群中是否存在AGV2,建立检测AGV2血清学诊断方法,本研究对扬州部分活禽市场鸡群及人群血清样本进行了AGV2检测,并对阳性样品进行了AGV2的VP1、VP2、VP3基因克隆,原核、真核表达及多抗的制备。本研究的开展,首次明确了国内活禽市场鸡群及人群存在AGV2。AGV2的VP1、VP2、VP3的原核及真核表达载体及产物的获得,具有良好反应性的抗VP2和VP3的小鼠多克隆抗体制备,为建立AGV2血清学检测方法以及探究AGV2的VP2和VP3蛋白分子生物学特性打下了基础。1.国内活禽市场及人群AGV2的检测为明确国内鸡群及人群中是否存在AGV2,首先建立了检测AGV2的PCR方法。以TA克隆阳性质粒为模版进行的灵敏度检测发现,该PCR扩增AGV2的灵敏度可达2.7个拷贝数。对4个不同的活禽市场共54份鸡群羽囊组织样品以及人的178份血样样品的检测发现12个AGV2阳性样品,其中10个来自活禽市场鸡群,另2个来自人血清样品。4个不同活禽市场鸡群AGV2的阳性率分别为25%,12.5%,15.8%以及20%；人血清样品AGV2的阳性率为1.1%。氨基酸序列分析发现,本研究检测到的12个AGV2序列间的同源性为98.3%-100%,而与NCBI数据库中已报道的AGV2序列的同源性在92.2%-99.1%。值得注意的是,这12个AGV2序列与NCBI中AGV2原型株Ave3以及国内人源株China的相应序列的同源性分别仅为92.2%-93%以及93%-93.9%,而与检测于人及雪貂的CL33,G13和915F06007相应序列的同源性达99.1%。进化树进一步分析发现,国内检测到AGV2可以分为两个分支。另外,在一肿瘤发病鸡群的诊断与检测中发现,AGV2与CAV以及MDV存在共感染。这些研究结果表明,国内活性市场鸡群确实存在环形病毒AGV2,并被发现于人血清样品中。然AGV2的分子流行,致病性,与CAV、MDV混合感染对CAV以及MDV致病性的影响等尚待进一步研究。2.AGV2的VP1、VP2、VP3蛋白原核表达及多抗制备为获得建立AGV2血清学诊断用抗原,对AGV2的VP1、VP2、VP3蛋白进行了原核表达。利用商品化的重组酶ExnaseTM Ⅱ不经酶切,直接将VP1、VP2、VP3基因或片段的PCR产物分别与线性化的pGEX-6p-1载体进行快速重组构建了GST-VP1_1-462, GST-VP1_463-924,GST-VP1_925-1383,GST-VP1_735-1089,GST-VP2_1-348,GST-VP2_348-750以及GST-VP3等7个GST融合表达质粒。相应阳性克隆转化BL21后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE以及Western blot分析结果表明,GST-VP1463-924, GST-VP1735-1089, GST-VP21-348以及GST-VP3的表达产物具有可溶性,而其它蛋白主要以包涵体形式存在。可溶性GST-VP21-348以及GST-VP3蛋白经GST柱纯化后,GST-VP2_1-348以及GST-VP3蛋白浓度分别为1.6mg/ml及1.0mg/ml。纯化的GST-VP2_1-348以及GST-VP3蛋白经免疫小鼠,分别获得了ELISA效价达1万的抗GST-VP2以及GST-VP3的小鼠多克隆抗体。这些AGV2的VP1、VP2、VP3原核表达载体的构建,表达产物及多抗的获得为进一步建立AGV2血清学诊断方法提供了原核表达抗原,为研究AGV2生物学特性提供了试剂。3.AGV2的VP2, VP3蛋白真核表达及其特性为进一步探究AGV2的VP2及VP3生物学功能,对AGV2的VP2及VP3基因进行了真核表达。利用商品化的重组酶ExnaseTM Ⅱ不经酶切,直接将VP2以及VP3基因PCR产物分别与线性化的pcDNA3.1(+)载体进行重组连接构建了pcDNA3.1-VP2以及pcDNA3.1-VP3真核表达质粒。重组质粒转染293T细胞36小时后,进行Western blot分析。、以抗GST-VP3以及GST-VP2_1-348的小鼠多克隆抗体为一抗进行的Western blot结果发现,在转染pcDNA3.1-VP2以及pcDNA3.1-VP3质粒的293T细胞中分别出现分子量大小为34kDa,14KDa的蛋白特异性条带。同时构建了EGFP-VP3融合表达载体。EGFP-VP3转染HCT116结肠癌肿瘤细胞后发现,EGFP-VP3定位于细胞核内,且呈散在的点状分布,类似凋亡小体。这些AGV2的VP2以及VP3真核表达载体的构建及其表达不仅为建立AGV2血清学诊断方法提供了真核表达抗原,而且为进一步研究AGV2 VP2及VP3功能打下了基础。
【关键词】：环形病毒AGV2 检测 VP1、VP2、VP3原核表达 多抗制备 VP2、VP3真核表达
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 符号说明9-10
• 文献综述 新型环形病毒AGV2研究进展10-16
• 1 AGV2的发现10-11
• 2 AGV2的检测报道11-12
• 3 AGV2基因组结构及蛋白功能12-14
• 4 本研究的目的和意义14-16
• 研究一 国内环形病毒AGV2的检测16-26
• 1 材料16-17
• 2 方法17-20
• 3 结果20-24
• 4 小结与讨论24-26
• 研究二 环形病毒AGV2的VP1-3蛋白的原核表达26-41
• 1 材料26
• 2 方法26-33
• 3 结果33-39
• 4 小结与讨论39-41
• 研究三 AGV2的VP2,VP3蛋白的真核表达及特性41-51
• 1 材料41
• 2 方法41-46
• 3 结果46-50
• 4 小结与讨论50-51
• 全文总结51-52
• 参考文献52-56
• 攻读学位期间发表的学术论文56-57
• 致谢57-58

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本文编号：827261