ANK1基因在弓形虫生长发育中的作用研究

发布时间：2017-09-11 07:03

  本文关键词：ANK1基因在弓形虫生长发育中的作用研究

  更多相关文章： 弓形虫 ANK1 CRISPR/Cas9 RNA-seq 缓殖子发育

【摘要】：弓形虫是一种宿主范围广泛的人畜共患寄生虫,可感染包括人在内的所有温血动物,全世界约有四分之一的人口感染弓形虫病。免疫力正常的宿主感染弓形虫后,在宿主免疫压力的作用下,弓形虫会在宿主体内转变成缓殖子,以组织包囊形式存在,造成机体的终生慢性感染。当机体的免疫力下降时,包囊内的缓殖子会再活化,形成速殖子,造成宿主急性感染。弓形虫速殖子与缓殖子相互转化在弓形虫病传播与发病中起到重要作用。在弓形虫速殖子与缓殖子相互转化过程中,约有400个基因的表达会发生明显变化,但是这些基因在缓殖子形成中的作用仍不清楚,而鉴定它们在缓殖子形成中的作用可以为理解缓殖子发育的分子机制奠定基础,,为弓形虫疫苗设计提供理论依据。本研究选取一个含有三十四肽重复结构域的缓殖子期上调基因ANK1,利用CRISPR/Cas9系统将ANK1基因在PRU株中敲除,获得了ANK1基因缺失株,通过比较敲除株与野生株生长、复制和毒力的差异,发现与野生株相比,敲除株在生长、复制和毒力方面均有缺陷。具体工作包括以下几个方面:(1)ANK1蛋白N-端及全长的原核表达构建pE-SUMO-ANK1-Nter和pE-SUMO-ANK1原核表达质粒,将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中并进行原核表达。在37℃诱导条件下,ANK1蛋白N端和全长均能得到高效表达,但ANK1蛋白全长主要以包涵体的形式存在。优化诱导表达条件发现,当大肠杆菌OD600值达1.5时,16℃用终浓度为0.1mM的IPTG诱导可提高蛋白在上清中的表达量。(2)ANK1敲除株的构建利用CRISPR/Cas9系统对ANK1基因进行敲除。首先,构建ANK1基因特异性CRISPR质粒pSAG1-Cas9-U6-ANK1和同源模板质粒pANK1-DHFR,然后将同源模板片段和pSAG1-Cas9-U6-ANK1质粒共电转到PRU速殖子中,用乙胺嘧啶进行筛选并用限制稀释法在96孔板中获取单克隆,经扩大培养后用PCR进行鉴定,结果显示成功获得ANK1敲除株。(3)ANK1敲除株表型研究通过空斑实验比较敲除株和野生株生长的差异,发现敲除株的生长明显比野生株慢;通过复制实验比较野生株和敲除株在虫体复制方面的差异,发现与野生株相比敲除株在复制方面有明显的缺陷;通过小鼠毒力实验比较野生株和敲除株对小鼠的毒力情况,发现与野生株相比,敲除株的毒力明显下降。小鼠保护力实验显示,经ANK1敲除株免疫的小鼠对致死剂量的野生型虫株有很好的抗性,证明了敲除株的免疫保护性为100%。(4)RNA-seq寻找野生株与敲除株的基因表达差异体外培养敲除株和野生株获得速殖子,体外碱性诱导敲除株和野生株形成缓殖子,提取速殖子和缓殖子RNA,利用RNA-seq寻找野生株与敲除株表达量有差异的基因。本研究中,共找到430个缓殖子期敲除株和野生株表达量有差异的基因;510个速殖子期敲除株和野生株表达有差异的基因。本研究利用CRISPR/Cas技术将ANK1基因在PRU中进行敲除,成功获得单克隆敲除株。与野生株PRU比较发现,敲除株在生长、复制和小鼠毒力方面有明显的缺陷,并且敲除株对小鼠具有很好的保护力,有成为基因工程疫苗的潜力。通过RNA-seq发现敲除株和野生株在缓殖子期有430个基因的表达量有明显差异,而在速殖子期有510个基因的表达量有明显差异,为进一步研究ANK1影响弓形虫生长发育的分子机制奠定了基础。
【关键词】：弓形虫 ANK1 CRISPR/Cas9 RNA-seq 缓殖子发育
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 缩略语表11-12
• 1．文献综述12-21
• 1.1 弓形虫综述12-14
• 1.1.1 弓形虫与弓形虫病12
• 1.1.2 弓形虫生活史12-13
• 1.1.3 弓形虫病治疗与疫苗13-14
• 1.2 弓形虫缓殖子分化发育研究进展14-18
• 1.2.1 弓形虫缓殖子形成14-15
• 1.2.2 宿主细胞对弓形虫缓殖子发育的影响15
• 1.2.3 弓形虫自身调控机制对缓殖子分化发育的影响15-18
• 1.3 三十四肽重复结构域研究进展18-19
• 1.4 CRISPR/CAS9系统研究进展19-21
• 2．研究目的与意义21-22
• 3．材料与方法22-36
• 3.1 实验材料22-23
• 3.1.1 实验动物22
• 3.1.2 实验菌株、虫株与细胞22
• 3.1.3 载体与质粒22
• 3.1.4 引物22-23
• 3.2 主要仪器与试剂23-25
• 3.2.1 主要仪器23
• 3.2.2 主要试剂盒23
• 3.2.3 主要试剂23-24
• 3.2.4 主要溶液的配制24-25
• 3.3 实验方法25-36
• 3.3.1 弓形虫的体外培养25
• 3.3.2 弓形虫基因组DNA的提取25-26
• 3.3.3 弓形虫RNA的提取26
• 3.3.4 弓形虫cDNA的制备26-27
• 3.3.5 基因敲除相关质粒的构建27-29
• 3.3.6 重组蛋白的原核表达29
• 3.3.7 His融合蛋白的镍柱纯化29-30
• 3.3.8 纯化蛋白的透析与保存30
• 3.3.9 BCA法蛋白质浓度测定30-31
• 3.3.10 ANK1敲除株的构建及鉴定31-33
• 3.3.11 空斑实验33
• 3.3.12 复制实验33
• 3.3.13 弓形虫虫株毒力实验33-34
• 3.3.14 弓形虫脑包囊计数34
• 3.3.15 敲除株对小鼠保护力实验34
• 3.3.16 体外诱导弓形虫缓殖子形成34-35
• 3.3.17 RNA-seq检测敲除株与野生株基因表达差异35-36
• 4．结果与分析36-55
• 4.1 弓形虫ANK1蛋白N-端及全长原核表达、蛋白纯化36-41
• 4.1.1 ANK1基因N-端及全长片段扩增36
• 4.1.2 ANK1基因N-端及全长表达质粒构建36-37
• 4.1.3 ANK1蛋白N-端及全长原核表达37-39
• 4.1.4 ANK1蛋白全长表达条件的优化39
• 4.1.5 ANK1蛋白N-端及全长蛋白纯化39-41
• 4.2 ANK1敲除质粒的构建41-45
• 4.2.1.pANK1-DHFR质粒的构建41-43
• 4.2.2 ANK1敲除株的构建43-44
• 4.2.3 ANK1敲除株鉴定44-45
• 4.3 ANK1敲除株表型研究45-50
• 4.3.1 空斑实验45
• 4.3.2 复制实验45-46
• 4.3.3 毒力实验46-47
• 4.3.4 小鼠脑包囊形成实验47-48
• 4.3.5 不同剂量敲除株对小鼠毒力48-49
• 4.3.6 小鼠保护力实验49-50
• 4.4 RNA-seq检测ANK1敲除株与野生株基因表达差异50-55
• 4.4.1 野生株和敲除株速殖子与缓殖子RNA样本的制备50-51
• 4.4.2 RNA-seq检测敲除株与野生株基因表达量差异51-55
• 5．讨论55-59
• 5.1 弓形虫ANK1蛋白N-端及全长的原核表达55
• 5.2 弓形虫ANK1基因敲除株的构建及表型研究55-57
• 5.3 RNA-seq检测敲除株与野生株基因差异性表达57-59
• 6．结论59
• 7．展望59-60
• 参考文献60-67
• 致谢67-68

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 李学瑞;赵象忠;王艳华;张德林;;弓形虫速殖子与弓形虫缓殖子相互转换的研究进展[J];畜牧与兽医;2006年02期

2 ;[J];;年期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 姚云英;对比研究Prugniaud株弓形虫速殖子和缓殖子中microRNA的表达[D];南方医科大学;2013年

2 张加勤;弓形虫LDH2基因启动子的克隆及初步鉴定[D];山东大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前7条

1 刁慧艳;ANK1基因在弓形虫生长发育中的作用研究[D];华中农业大学;2016年

2 施远香;弓形虫速殖子与缓殖子体外相互转换模型的构建[D];中南大学;2014年

3 袁园;运输应激条件下弓形虫缓殖子向速殖子转化差异蛋白的筛选及鉴定[D];华中农业大学;2015年

4 王琼;弓形虫缓殖子期特异性抗原的基因克隆、蛋白表达及重组BAG1抗原的初步应用[D];南方医科大学;2007年

5 程健曦;IFN-γ抑制弓形虫缓殖子向速殖子转化的研究[D];华中农业大学;2013年

6 丁洁琼;弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系的建立及BAG1基因在转化中作用的初步研究[D];南方医科大学;2010年

7 张敏;弓形虫缓殖子抗原SAG2C/2D/2X核酸疫苗及优势表位抗弓形虫慢性感染的实验研究[D];山东大学;2014年

，

本文编号：829268