基于ELP-Hsp90α融合蛋白IBDV浓缩和纯化方法的建立与应用

发布时间：2017-09-11 09:23

  本文关键词：基于ELP-Hsp90α融合蛋白IBDV浓缩和纯化方法的建立与应用

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【摘要】：传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是鸡的一种高度接触性传染病,主要侵害3-6周龄鸡的法氏囊,导致严重的免疫抑制、免疫失败和对其他病原的易感性增强,给世界养禽业造成巨大的经济损失。传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)是双RNA病毒科成员,病毒颗粒无囊膜,对热、pH3-9和有机溶剂稳定,因此可用氯仿和聚乙二醇沉淀和浓缩,用蔗糖或氯化铯密度梯度离心和凝胶过滤等方法纯化,但这些方法具有费时、费钱和回收率低等缺点。病毒受体结合捕捉(Virus receptor-binding capture)技术利用病毒受体偶联的磁珠等固相载体从组织和环境样品中捕捉病毒,具有简单、快速和经济等优点,与PCR等技术相结合已成功用于病毒的环境监测。用类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)取代固相载体,本课题组建立了更为简单、经济的腺病毒浓缩与纯化方法。热应激蛋白90a (Heat shock protein 90a, Hsp90a)是IBDV受体复合物成分,本课题组的前期研究结果显示Hsp90a C端444个氨基酸区域(C444)能与IBDV结合,为建立Hsp90a结合IBDV捕捉方法奠定了基础。本研究将C444区分为3段与ELP进行融合表达,在进一步明确IBDV结合区的基础上,用其ELP融合蛋白建立了IBDV快速浓缩与纯化方法。将Hsp90a的C444区分为283-449、356-606和597-728位氨基酸3个部分重叠的片段,将PCR扩增的编码序列分别与ELP序列融合,构建原核表达载体pELP-283-449、pELP-356-606和pELP-597-728。将重组载体转化BLR大肠杆菌,用IPTG在20℃诱导融合蛋白表达,利用ELP的温度敏感可逆相变循环(ITC)获得了纯度较高的融合蛋白ELP-283-449、 ELP-356-606和ELP-597-728。分别将纯化的融合蛋白与IBDV进行共孵育,利用ITC沉淀融合蛋白-病毒复合物,经RT-PCR检测证明,ELP-283-449融合蛋白能与IBDV结合。将不同浓度的ELP-283-449融合蛋白与IBDV混合,在不同pH和温度下孵育不同时间,用ITC沉淀结合的IBDV,病毒滴定结果显示ELP-283-449结合IBDV的最佳条件为160μg/mL蛋白、16℃、pH7.0和1h。将沉淀的融合蛋白-IBDV复合物在不同pH和温度下洗脱不同时间,病毒滴定结果显示洗脱IBDV的最佳条件为22℃、pH9.0和30min。在优化条件下用ELP-283-449融合蛋白分别从IBDV感染细胞培养上清和裂解细胞中浓缩和纯化病毒,病毒滴定结果显示IBDV的回收率分别为75.4%和71.7%。在优化条件下进行IBDV洗脱,结果显示洗脱病毒的回收率分别为39.3%和42.5%。将不同浓度IBDV接种自来水和PBS,然后用ELP-283-449融合蛋白进行病毒浓缩和回收,结果显示ELP-283-449融合蛋白捕获PBS和自来水中IBDV的效率分别为73%和68%。这些研究结果表明：热应激蛋白90a的IBDV结合区位于其283～449位氨基酸区域,ELP-283-449融合蛋白可用于组织和环境样品中IBDV的浓缩与纯化。
【关键词】：传染性法氏囊病病毒 热应激蛋白90α 类弹性蛋白多肽 融合表达 病毒浓缩与纯化
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 中英文简写8-9
• 文献综述9-19
• 一、传染性法氏囊病毒研究进展9-13
• 1. 概述9
• 2. 病毒蛋白及功能9-10
• 3. 致病机理10-11
• 4. 免疫预防11-13
• 二、IBDV受体的研究进展13-19
• 1. 病毒受体概述13-14
• 2. 病毒受体的研究方法14-16
• 3. IBDV受体的研究进展16-17
• 4. 病毒受体的应用17-19
• 研究内容一：Hsp90α片段与ELP的融合表达及IBDV结合区的确定19-35
• 1. 材料和方法19-30
• 1.1 材料19-22
• 1.2 方法22-30
• 1.2.1 目的片段的克隆与鉴定22-25
• 1.2.2 表达载体的构建25-27
• 1.2.3 融合蛋白的诱导表达与分析27-29
• 1.2.4 重组蛋白的纯化29
• 1.2.5 IBDV结合区的确定29-30
• 2. 结果30-34
• 2.1 表达构建与鉴定30-31
• 2.2 融合蛋白的表达31-32
• 2.3 融合蛋白的纯化32-33
• 2.4 融合蛋白IBDV结合区鉴定33-34
• 3. 讨论34-35
• 研究内容二：IBDV快速浓缩与纯化方法的建立与应用35-46
• 1. 材料与方法35-39
• 1.1 材料35-36
• 1.2 方法36-38
• 1.2.1 IBDV滴定36-37
• 1.2.2 融合蛋白结合IBDV的条件优化37-38
• 1.2.3 IBDV洗脱条件的优化38
• 1.3 IBDV快速浓缩与纯化方法的应用38-39
• 2. 结果39-43
• 2.239-43
• 2.2.1 IBDV的滴度测定39
• 2.2.2 融合蛋白结合IBDV的条件优化39-41
• 2.2.3 IBDV洗脱条件的优化41-43
• 2.3 IBDV快速浓缩与纯化方法的应用43
• 3. 讨论43-46
• 全文总结46-47
• 参考文献47-55
• 致谢55-56

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1 王璋瑜;;蛋白设计实验室公司买下融合蛋白技术实用权[J];生物技术通报;1990年10期

2 张毅,屈贤铭,杨胜利;融合蛋白基因工程应用及研究[J];生物工程进展;2000年03期

3 杨林,李国清,黄葆英,王全忠,龙綮新,王s阏，

本文编号：829898